UPLC—MS/MS法測(cè)定蝦肉中氯霉素殘留量的不確定度分析

李 濤

周艷華2

楊 滔1

孫桂芳1

(1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410111；2. 長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004)

UPLC—MS/MS法測(cè)定蝦肉中氯霉素殘留量的不確定度分析

李 濤1

周艷華2

楊 滔1

孫桂芳1

(1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410111；2. 長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004)

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC—MS/MS)法測(cè)定Fapas能力驗(yàn)證項(xiàng)目蝦肉中氯霉素的殘留量，并進(jìn)行不確定度評(píng)定，給出了不確定度。先建立了測(cè)定蝦肉中氯霉素殘留量的不確定度的數(shù)學(xué)模型，再對(duì)不確定度來源進(jìn)行分析。通過對(duì)不確定度分量進(jìn)行量化和合成，得出當(dāng)蝦肉中氯霉素殘留量為0.820 8 μg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.146 2 μg/kg(k=2)，結(jié)果符合Fapas能力驗(yàn)證指定范圍。評(píng)定結(jié)果表明，UPLC—MS/MS法測(cè)定蝦肉中氯霉素試驗(yàn)過程中，樣品稱量、樣品提取、校準(zhǔn)曲線的配制、質(zhì)譜測(cè)定、校準(zhǔn)曲線的擬合等過程都會(huì)引入不確定度，其中，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的不確定度最大。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC—MS/MS)；蝦；氯霉素；不確定度；Fapas

測(cè)量不確定度簡(jiǎn)稱不確定度，是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)[1]。不確定度大小反應(yīng)測(cè)量水平的高低，直接影響到產(chǎn)品合格判定。不確定分析對(duì)于質(zhì)量控制具有重要意義，GB/T 27025—2008/ISO/IEC 17025:2005明確了檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有應(yīng)用評(píng)定測(cè)量不確定的程序。

氯霉素是一類廣譜抗生素，曾在中國畜牧水產(chǎn)業(yè)中被廣泛應(yīng)用[2-3]，但其對(duì)人類有很大的毒副作用，可抑制人類骨髓造血功能，引起再生性障礙貧血和其他血液病等[4]。中國已于2002年禁止使用氯霉素，并要求所有動(dòng)物可食組織中不得檢出氯霉素[5]。但少量不法分子為降低成本，仍少量使用效價(jià)高、價(jià)格低廉的氯霉素。氯霉素檢測(cè)方法有液質(zhì)法[6-8]、氣相色譜法[9]、氣質(zhì)法[10]、電化學(xué)法[11]、傳感器法[12-13]和膠體金法[14]等。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC—MS/MS)是氯霉素檢測(cè)使用最廣泛的方法，其具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，氯霉素檢出限為0.1 μg/kg，為確保檢出結(jié)果的可信度，必須進(jìn)行不確定度的評(píng)定[15-16]。

英國Fapas能力驗(yàn)證是專門用于食品檢測(cè)分析方面的能力評(píng)估體系，通過實(shí)驗(yàn)室間測(cè)試結(jié)果的比對(duì)來判定實(shí)驗(yàn)室能力的合格評(píng)定活動(dòng)。本試驗(yàn)采用UPLC—MS/MS法測(cè)定Fapas能力驗(yàn)證項(xiàng)目蝦肉中氯霉素殘留量，依據(jù)JF 1059.1—2012和JJF 1135—2005評(píng)定整個(gè)試驗(yàn)過程的不確定度，為檢驗(yàn)數(shù)據(jù)上報(bào)提供提供科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)，確保檢出結(jié)果的可信度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素(純度為98.6%)、氘代氯霉素(純度為 98.0%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司；

甲醇、乙腈、乙酸銨：色譜純；

蝦肉和蝦肉空白基質(zhì)：FAPAS 中國代理處。

1.2 儀器與設(shè)備

超高壓液相色譜儀：LC-30型，日本島津公司；

串聯(lián)質(zhì)譜儀：API 5500型，美國 AB Sciex 公司；

電子分析天平：BS224S型，德國賽多利斯公司；

臺(tái)式冷凍離心機(jī)：X1R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

漩渦振蕩器：HMS-350型，上海珂淮儀器有限公司；

氮吹儀：MV-5型，北京萊伯泰科股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理方法 準(zhǔn)確稱取約2.0 g樣品(精確至0.1 mg)于50 mL離心管中，加入乙腈10 mL，10 ng 氘代氯霉素，振搖10 min后6 000 r/min離心10 min，取上清液，加入乙腈10 mL提取第2次，合并2次上清液，轉(zhuǎn)移至氮吹管，45 ℃氮吹干，超純水定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜后，進(jìn)行UPLC—MS/MS 測(cè)定。

1.3.2 UPLC—MS/MS測(cè)定色譜條件 色譜柱：Hypersil Gold C18液相色譜柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相：A相為水，B相為乙腈，C相為10 mmol/L乙酸銨，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

1.3.3 UPLC—MS/MS測(cè)定質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子化(ESI)負(fù)離子模式；氣簾氣： 172.3 kPa，鞘氣275.8 kPa，輔助氣275.8 kPa，碰撞氣中等，離子化電壓-4 500 V，霧化溫度550 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描(MRM)采集參數(shù)見表 2。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立 氯霉素殘留量按式(1)計(jì)算：

X=C×V/m，

(1)

式中：

X——樣品中待測(cè)組分殘留量，μg/kg；

C——待測(cè)組分校準(zhǔn)工作液的濃度，ng/mL；

V——樣品溶液最終定容體積，mL；

表2 液質(zhì)采集參數(shù)表

M——樣品稱樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 校準(zhǔn)曲線的測(cè)定 測(cè)得校準(zhǔn)曲線方程為y=0.201 62x+0.008 63，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

2.1.2 樣品重復(fù)性試驗(yàn) 平行處理6份供試樣，結(jié)果分別為0.831 3，0.826 7，0.816 8，0.808 9，0.800 9，0.840 3 μg/kg，平均值為0.820 8 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.017 9 μg/kg。

2.1.3 樣品回收率試驗(yàn) 取約2 g蝦肉空白基質(zhì)2份，添加與樣品濃度相當(dāng)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，同試樣處理方法，進(jìn)行UPLC—MS/MS測(cè)定，得到蝦肉中氯霉素的回收率分別98.2%和99.1%。

2.2 不確定度來源分析

根據(jù)前處理及測(cè)定，對(duì)樣品中氯霉素殘留量測(cè)定結(jié)果有影響的各種不確定的分量來源進(jìn)行分析，不確定度因素引入見圖1。由圖1可知，樣品稱量、樣品溶液制備定容、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制、測(cè)量重復(fù)性、回收率都會(huì)給檢驗(yàn)結(jié)果引入不確定度。

圖1 氯霉素測(cè)定不確定度來源圖

2.3 不確定度分析與評(píng)定

2.3.3 待測(cè)組分濃度不確定度urel(C)urel(C)的不確定度包括校準(zhǔn)溶液配制和校準(zhǔn)曲線擬合不確定度。校準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度有校準(zhǔn)物質(zhì)純度、儲(chǔ)備液配制、校準(zhǔn)溶液的配制和溫度變化；校準(zhǔn)曲線擬合引入不確定包括校準(zhǔn)溶液濃度、儀器波動(dòng)和溫度變化。

(1) 校準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的不確定度urel(C1)。

(4) 校準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(C4)：校準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行UPLC—MS/MS測(cè)定，通過Excel擬合為校準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)曲線為y=0.201 62x+0.008 63，校準(zhǔn)曲線擬合不確定度計(jì)算程序僅與響應(yīng)值有關(guān)，與校準(zhǔn)溶液的不確定度無關(guān)[17]。氯霉素校準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果見表4。

校準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度：

(2)

(3)

urel(C4)=u(C4)/c0=0.065 5/0.82=0.079 9，

(4)

式中:

sA——校準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)差；

p——樣品溶液的測(cè)定次數(shù)，p= 6；

N——校準(zhǔn)溶液(含空白溶液) 的測(cè)定次數(shù)，N= 6；

b——校準(zhǔn)曲線的斜率；

a——校準(zhǔn)曲線的截距；

c0——由校準(zhǔn)曲線方程求得的樣品溶液中待測(cè)物的濃度，μg/L；

表3 校準(zhǔn)系列溶液稀釋步驟引入的不確定度

表4 氯霉素校準(zhǔn)溶液測(cè)定結(jié)果?

?p=5，N=6，c均=5.0 μg/mL，c0=0.82 μg/L，b=0.201 62。

c均——各校準(zhǔn)溶液濃度配制值的平均值，μg/L；

ci——各校準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液的濃度點(diǎn)的配制值；

cj——由校準(zhǔn)曲線方程得出的校準(zhǔn)溶液的測(cè)定值，μg/L。

2.3.6 合成的相對(duì)不確定度 相對(duì)不確定度分量見表5，將各相對(duì)不確定分量進(jìn)行合成。

表5 相對(duì)不確定度分量匯總表

2.3.7 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表述 依據(jù)JJF 1135—2005，對(duì)于大多數(shù)測(cè)量采用包含因子k=2，則UPLC—MS/MS法測(cè)定蝦肉中氯霉素殘留量的擴(kuò)展不確定度U=2×urel(X)=2×0.073 1=0.146 2，結(jié)果表述為蝦肉中氯霉素殘留量為(0.820 8±0.146 2) μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

本次試驗(yàn)蝦肉中氯霉素殘留量測(cè)定為2016年11月Fapas國際能力比對(duì)項(xiàng)目，共110家單位參加，氯霉素殘留量指定值0.857 μg/kg，檢驗(yàn)結(jié)果氯霉素殘留量0.821 μg/kg，CCβ為0.1，z-score為-0.2，表明本次試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)可靠。

UPLC—MS/MS法測(cè)定蝦肉中氯霉素試驗(yàn)過程中，樣品稱量、樣品提取、校準(zhǔn)曲線的配制、質(zhì)譜測(cè)定、校準(zhǔn)曲線的擬合等過程都會(huì)引入不確定度。本試驗(yàn)通過對(duì)試驗(yàn)過程中的玻璃器皿、溫度變化、溶液稀釋配制、重復(fù)測(cè)定、回收率等因素帶來的不確定度進(jìn)行評(píng)定，由于樣品中氯霉素殘留量低，標(biāo)準(zhǔn)品需經(jīng)過多次稀釋，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合引入的不確定度最大。前處理過程及標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加了內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，重復(fù)率和回收率的結(jié)果均比較好，引入的不確定度較小。UPLC—MS/MS靈敏度高，選擇性強(qiáng)，但測(cè)試穩(wěn)定性不強(qiáng)，因此測(cè)試過程會(huì)帶來較大的不確定度。在試驗(yàn)操作過程中，嚴(yán)格規(guī)范操作，提高操作熟練度，增加混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測(cè)定次數(shù)，保持儀器的靈敏度，可保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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Uncertainty analysis of determination of chloramphenicol residue in shrimp by UPLC-MS/MS method

LITao1

ZHOUYan-hua2

YANGTao1

SUNGui-fang1

(1.HunanProvincialFoodQualitySupervisionandInspectionInstitute,Changsha,Hunan410011,China; 2.ChangshaEnvironmentalProtectionVoctionalCollege,Changsha,Hunan410004,China)

In this paper, the Fapas ability was used to verify the chloramphenicol residues in shrimp meat by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS), and the uncertainty was evaluated. Uncertainty was given. First, a mathematical model for determining the uncertainty of chloramphenicol residues in shrimp was established, and then the source of uncertainty was analyzed. The uncertainty of the uncertainty was 0.146 2 μg/kg (k= 2) when the chloramphenicol residues in the shrimp were 0.820 8 μg/ kg, and the results were in accordance with the Fapas ability test. Specify the scope. The results showed that the UPLC-MS / MS method was used to determine the uncertainty of the process of determination of chloramphenicol in shrimp，sample weighing, sample extraction, calibration curve, mass spectrometry and calibration curve etc were the major infact for uncertainty. The standard series solution formulation and the fitting of the standard curve were introduced with the greatest uncertainty.

ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); prawn; chloramphenicol; uncertainty; Fapas

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2017JJ5062)

李濤，男，湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院助理研究員，碩士。

周艷華(1982—)，女，長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程師，碩士。E-mail: boylitao@163.com

2017—05—27

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.013