土壤中高效解磷菌的鑒定及其對皖南烤煙幼苗生長的影響

汪志宇　岳耀穩

摘要 從皖南地區200多個土壤樣品中分離、篩選出4株能降解無機磷的優勢菌株GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2，并通過實驗室培養測定其解磷能力，分別為11.92 %、8.25%、7.48%、3.49%。將其接種于烤煙幼苗，考察其對烤煙幼苗生長的影響。結果表明，在充分供應烤煙幼苗氮、鉀等其他營養元素的情況下，解磷菌株能夠不同程度地發揮解磷效果，在其影響下，煙株各部位鮮重、干重及葉綠素含量較不接菌的對照顯著增加，根系活力較對照明顯增強，其中，GY22-3-2菌株較其他菌株表現出更強的解磷能力，解磷效果較好。

關鍵詞 烤煙；解磷菌；解磷能力；鑒定；幼苗生長

中圖分類號 S572 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）16-0029-02

磷是高等植物生長所必需的大量礦質元素之一，然而土壤中95%以上的磷呈有機（含量約占全磷含量的50%以上）或無機磷化物狀態存在，水溶性很低，很難被植物直接吸收利用，只有很少比例的速效態磷能被植物直接利用，從而造成了世界范圍內磷素的缺乏。解決這一問題有2條途徑：一是增加磷源投入，二是提高難溶性磷的利用率。從農業可持續發展來看，增加磷源投入存在一定的問題，而提高難溶性磷的利用率的潛力則很大，它是對土壤中磷及所施入的磷肥進行活化提高其有效性，走低投入高產出的可持續發展道路。本試驗從安徽省皖南地區采集的土樣中分離篩選出了4株能降解無機磷的微生物，并進一步純化鑒定，初步測定了它們的解磷能力，并將其接種于烤煙幼苗，觀察測定其對烤煙幼苗生長的促進作用，最終確定具有較高解磷能力的菌株，為進一步研究土壤微生物解磷機制及開發解磷菌株制劑奠定堅實的基礎[1-3]。

1 材料與方法

1.1 試驗土概況

本試驗分離解磷微生物用土采集自安徽省皖南地區的200多個土樣；盆栽試驗用土來自黃山市徽州區東山村，主要理化性狀：pH值6.2～6.7、全氮0.15 g/kg、全磷0.32 g/kg、全鉀19.7 g/kg、細菌2.1×106個/g土、放線菌3.5×106個/g土、真菌1×106個/g土、堿解氮24.5 mg/kg、速效磷1.9 mg/kg、速效鉀98 mg/kg。

1.2 供試材料

供試烤煙品種為云煙97。供試培養基為分離培養基：解磷菌株分離培養基（液體）（以下簡記為P1培養基）配方如下：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，磷酸鈣10 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.5，121 ℃滅菌30 min，pH值為6.8～7.3。解磷菌株分離培養基（固體）：瓊脂18～20 g，其他同液體培養基。斜面培養基成分與固體培養基相同。

1.3 菌株分離方法

涂布法：取野外采集土樣適量，研缽研細，稱取10 g粉末加入盛有100 mL無菌水的三角瓶中，25 ℃搖床恒溫振蕩30 min，取上清液作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液，各取0.2 mL該稀釋液涂布于平板培養基上，每個濃度重復3皿，28 ℃恒溫培養7 d。挑取單菌落轉至斜面培養至菌苔長起，置4 ℃冰箱保存，進一步篩選，共得224個菌株。

1.4 解磷能力的測定方法

1.4.1 菌株在固體培養基中解磷能力的測定。觀察溶鈣圈法：將初篩得到的224個菌株接種于無機磷固體培養基中，倒置于28 ℃恒溫箱中培養7 d，觀察有無溶鈣圈，并根據溶鈣圈的大小初步確定解磷效果。

1.4.2 菌株在液體培養基中解磷能力的測定。鉬酸銨定磷試劑比色法：將初篩得到的4個菌株GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2分別接種在滅過菌的P1液體培養基中，用不接菌的液體培養基作對照，28 ℃往復搖床144 r/min培養7 d。取過濾后的培養液測定培養液中可溶性磷的含量。

1.5 解磷菌株對煙草幼苗生長的促進作用試驗設計

采用盆栽法進行研究。試驗地點：皖南煙葉公司黃山煙葉經理部試驗基地；花盆規格12 cm×12 cm；栽培環境：溫室中；煙苗苗齡30 d。每株煙基施K2SO4 4 g、NH4NO3 2.5 g、緩苗后追施K2SO4 2 g、NH4NO3 1.5 g。

本試驗共設5個處理，分別是GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2、不接菌作對照（CK），3次重復。在煙苗移栽后第4天（基本緩苗）接種28 ℃ 144 r/min搖床培養7 d的菌株培養液和不接菌的培養液CK，每株20 mL。

接種后每10 d測1次株高，30 d后測煙株根、莖、葉鮮重、干重。根系活力采用TTC染色法[4-6]。葉綠素含量用研磨法。

1.6 數據處理方法

用DPS數據分析軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 菌株在固體培養基中分解Ca3（PO4）2的能力

從表1可以看出，CK各項指標均為0，說明在無微生物存在的情況下，Ca3（PO4）2在試驗條件下無釋放。而菌株GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的平板中都能產生透明圈，說明這4個菌株都能一定程度地分解Ca3（PO4）2。而在菌株GY22-3-2的周圍出現了較明顯的透明圈，說明在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的固體培養基中，菌株GY22-3-2的解磷能力最強，GY7-3-7、GY13-2-5菌株次之，GY2-4-2較差。

2.2 菌株在液體培養基中分解Ca3（PO4）2的能力endprint

從圖1可以看出，經過7 d的搖床培養，解磷菌株表現出不同的解磷能力。其中，菌株GY22-3-2的解磷能力最強，其效率高達11.92%；GY7-3-7次之，GY2-4-2較弱。其解磷能力較CK高86.25%～95.97%。

2.3 不同解磷菌株對烤煙幼苗生長的促進作用

2.3.1 對烤煙幼苗株高的影響。由于土壤中含有一定的速效磷，這部分磷在一定時間內足以供給烤煙幼苗生長對磷素的需求。因此，接種后10 d，各個處理間煙苗生長的差異不顯著。隨著煙苗的生長，土壤中的速效磷被耗盡，這時解磷菌株便不同程度地發揮解磷作用，將土壤中難溶性磷分解為可溶性的磷，供煙苗生長利用。從圖2可以看出，在固體和液體培養基中均表現良好解磷效果的GY22-3-2菌株始終處于最好水平，且隨時間的推移，解磷效果不斷快速增加，而表現較差的GY2-4-2菌株，雖然隨時間推移也在增加，但增加的幅度明顯沒有GY22-3-2高。說明在試驗條件下解磷效果越好的菌株，對煙苗生長的促進作用越明顯。

2.3.2 對烤煙幼苗根、莖、葉鮮、干重的影響。從圖3可以看出，對根、莖、葉鮮重的影響總的表現為GY22-3-2>GY7-3-7>GY13-2-5> GY2-4-2>CK。從圖4可以看出，不同解磷菌株對煙苗干重的影響與對鮮重的影響大致相同，對根、莖、葉干物質增加量的影響都是GY22-3-2>GY7-3-7>GY13-2-5> GY2-4-2>CK，施入解磷菌的處理與CK相比達顯著水平。煙株對氮、磷、鉀等各種營養元素的吸收存在一定的平衡關系，因此，在煙株生長過程中，其中任意一種元素的缺乏必然影響煙株對其他物質的吸收。在氮、鉀等供應充足的情況下，解磷效果較強的處理，由于解磷菌分解了大量的難溶性磷酸鹽，土壤中植物可利用的有效磷的含量大大增加，促進了煙株對其他物質的吸收，進而促進煙株的生長。

2.3.3 對煙草幼苗葉綠素含量的影響。從表2可看出，不同解磷菌株對煙苗葉綠素及類胡蘿卜素含量的影響比較明顯，處理GY22-3-2的各項指標均顯著高于其他處理，CK最差。一方面說明，與CK相比，各菌株均能在一定程度上改善土壤有效磷的供應狀況，促進煙株幼苗葉片葉綠素的形成；另一方面可以很清楚地看出，在供試菌株中，GY22-3-2菌株對葉綠素的影響明顯好于其他菌株，從對葉綠素含量的影響上再次證明該菌株的高解磷能力。

2.3.4 不同解磷菌株對煙草幼苗根系活力的影響。從圖5可以看出，在相同的氮、鉀水平條件下，不同的菌群接種到土壤中對煙株根系活力有不同的影響，解磷效果較好的菌株GY22-3-2其煙苗的根系活力也較強，其原因可能是解磷能力較強的菌株分泌出較多的磷酸酶，使土壤中難溶性磷酸鹽釋放出來，顯著增強根系周圍的酶活性，進一步促進了根系的發育，從而大大增強了煙苗的根系活力。

3 結論與討論

試驗結果表明，在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的培養基中，供試4個菌株都能不同程度地分解Ca3（PO4）2，從而產生透明圈。在充分供應氮、鉀等其他元素的情況下，解磷菌劑能夠促進煙草幼苗的生長發育，對葉綠素含量、干物質累積量有很大影響，尤其能夠促進烤煙幼苗側根的發生，使煙苗根系活力增強，提高煙苗素質。GY22-3-2菌株無論是在實驗室條件下培養基中的解磷效果，還是在土壤條件下對烤煙幼苗生長的促進效果上，均明顯好于其他菌株。在測定菌株分解Ca3（PO4）2的能力的過程中，發現在平板中產生透明圈較大的菌株GY22-3-2，在液體培養基中的解磷能力也最強，但是，這僅僅說明該菌株對該狀態的Ca3（PO4）2分解能力強，對土壤中存在的Ca8-p、Ca10-p、Fe-p和Al-p的分解能力是否強還需要進一步研究。雖然本試驗中解磷菌對煙苗生長的促進作用比較明顯，在一定程度上能夠說明解磷菌在土壤中的解磷效果較好，但是，因為本試驗是在可調控溫濕度的大棚中進行，且栽培時間較短，存在很多偶然性。若將其應用于大田生產，因其環境條件可人為控制因素不大，尤其在煙草生長季節，一般情況下降雨量較多，且土壤中固有的大量微生物與解磷菌存在激烈的競爭作用，這些原因都會導致解磷菌的解磷能力降低甚至消失，或者使解磷菌死亡。另外，本試驗只分離出具有解磷能力的微生物，而沒有分析鑒定其分類，這有待進一步研究，確定其類別和生長習性，以便為解磷菌在土壤中最大程度地發揮解磷效果的環境條件的確定提供理論依據。

4 致謝

感謝云南省煙草科學研究所提供這次實習機會！在試驗操作過程中，得到了云南省煙草科學研究所高家合、廖德智、張紅艷3位老師的大力支持；同時，張英、馬方磊等幾位同學也提供了許多幫助。在此次論文撰寫過程中，年夫照博士對本人進行了悉心指導，在此一并致以最誠摯的謝意！

5 參考文獻

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