神經肽優洛可定對丘腦底核神經元自發放電影響與CRF-2R關系研究

田 飛, 劉春娜，劉新宇，陳秋元,丁宇豪

(1. 汕頭大學醫學院第二附屬醫院神經外科，廣東 汕頭 515041；2. 錦州醫科大學藥理學教研室，遼寧 錦州 121000)

神經肽優洛可定對丘腦底核神經元自發放電影響與CRF-2R關系研究

田 飛1, 劉春娜2，劉新宇2，陳秋元2,丁宇豪2

(1. 汕頭大學醫學院第二附屬醫院神經外科，廣東 汕頭 515041；2. 錦州醫科大學藥理學教研室，遼寧 錦州 121000)

目的研究神經內分泌生物活性肽優洛可定(urocortin，UCN)對丘腦底核(subthalamic nucleus, STN)神經元放電及STN中多巴胺(dopamine, DA)能、谷氨酸(glutamic acid, GLU)能神經傳遞的影響，研究UCN在STN中是否與GLU及DA存在匯聚作用，探討UCN在帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)發生中可能發揮的作用。方法取40只SD大鼠，采用神經電生理實驗方法中的微電泳技術，在微電泳UCN過程中，觀察STN神經元放電的波形及頻率變化，同時，微電泳Astressin(AST)及蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)抑制劑，觀察促皮質素釋放因子2型受體(corticotropin releasing factor 2 receptor，CRF-2R)是否參與UCN對STN 神經元放電的影響。另外，在微電泳DA和GLU過程中，給予UCN及AST，觀察STN神經元放電的變化，明確是否存在DA能及GLU能與UCN的交匯作用。結果微電泳UCN過程中，82%(27/33)STN神經元頻率減慢。STN平均放電頻率由(3.65±0.27)Hz減少到(2.05±0.33)Hz，微電泳UCN前、后STN放電頻率明顯降低(P<0.01)。另外，UCN抑制作用可被AST明顯拮抗 (P<0.01), UCN抑制作用也可被PKA阻斷劑部分阻斷。在微電泳抑制性神經遞質DA和興奮性GLU過程中，UCN能進一步協同DA的抑制效應，并明顯拮抗GLU的興奮作用(P<0.01)。結論UCN與DA能及GLU能在STN神經元中存在匯聚作用，UCN可能是通過與CRF-2R 結合，進而通過PKA信號通路，影響DA能、GLU能神經遞質活動，抑制STN 神經元放電。

丘腦底核；多巴胺；谷氨酸；帕金森疾??；優洛可定；微電泳

丘腦底核(subthalamic nucleus，STN)是基底神經節(basal ganglia，Bgl)重要的核團之一，主要調控機體的運動功能及行為。蒼白球(globus pallidus，Gpe)和黑質網狀部之間的重要中繼站就是STN，在調節Bgl神經核團之間的生理功能及病理活動中起關鍵的整合作用[1-2]。神經內分泌生物活性肽優洛可定(urocortin，UCN)是由下丘腦分泌，具有多種神經及心血管功能[3]。目前的研究表明，UCN 在生理及病理情況下可能對中樞神經系統(central nervous system, CNS)具有保護功能[4-5]。在本實驗室既往的研究中發現，UCN對Bgl的另一個主要核團——紋狀體(striatum, STR)的自發放電有抑制作用[6]，另外，也發現UCN能通過抑制STR的多巴胺(dopamine，DA)神經元功能，同時抑制興奮性神經遞質的興奮毒性，可能在帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)中發揮治療作用[7]。但目前，UCN對STN的神經元放電的影響及對STN內神經遞質(如興奮性神經遞質GLU及抑制性遞質DA)的調節作用未見報道。本實驗選用神經電生理中常用且經典的微電泳技術，結合細胞外記錄的實驗方法，微電泳UCN、促皮質素釋放因子2型受體(corticotropin releasing factor 2 receptor， CRF-2R)抑制劑 Astressin(AST)，監測兩者對STN 神經元放電頻率及波形影響，同時監測UCN對STN中抑制性DA能、興奮性GLU能神經傳遞的改變，以探討STN內興奮及抑制性神經遞質間的相互平衡及制約作用，及可能的神經通路機制。目前，很多研究已明確STN是導致PD的重要核團[8]。因此，本研究將為臨床治療神經系統常見疾病，如PD的診斷及治療，提供有效而可靠的藥物作用靶點。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，由錦州醫科大學實驗動物中心提供，體質量180～220 g，動物合格證號：SCXK(遼) 2007-0009。UCN(10-6mol·L-1)；Astressin(AST，CRF-2R的受體阻斷劑，10-6mol·L-1)；DA 0.5 mol·L-1；Cropromazine(CPM，為DA受體的阻斷劑，1.0 mol·L-1)；GLU(1.0 mol·L-1)；MK-801(NMDA受體的常用阻斷劑，1.0 mol·L-1)；PKA及H-89，上述藥品及試劑全部購自美國Sigma公司。

1.2麻醉開顱并對STN定位取40只上述SD大鼠，烏拉坦腹腔注射(1 g·kg-1)全麻，麻醉成功后，將大鼠置于腦立體定位儀，定位STN，常規開顱術開顱。根據Paxions & Watson大鼠腦圖譜，確定STN的坐標：中線旁開2.5～3.0 mm，前囟后3.8～4.0 mm，腦表下7.0～8.0 mm。

1.3微電泳受試藥物采用神經電生理學實驗方法中的微電泳技術(51-217 型微管拉制儀，美國STOELTING公司)及神經元細胞外記錄相結合的實驗方法。拉制的7管玻璃微電極呈傘裝，中心管直徑為4～8 μm間，中心電阻在5～12 MΩ作用。含有1%滂胺天藍的NaCl溶液(3.0 mol·L-1)灌注于中心管內，作為本實驗用引導電極；另外6個外周管的電阻均應控制在20～100 MΩ之間，分別灌注下列受試藥物，包括UCN、AST、DA、CPM、GLU以及MK-801。1.4生物肽UCN對STN神經元放電影響微電極推進器將玻璃微電極接近定位的STN坐標位置，然后緩慢插入STN， DAM80 微電極放大器采集STN神經元單位放電，經過濾波后，示波器上顯示STN神經元放電波形，Spike2采集系統(英國CED公司)處理神經元輸入的生物電信號。在本實驗中，監測STN神經元自發放電情況，包括觀察STN放電波形、STN神經元傳出分布的方式及頻率、是否有爆發式放電、放電的基本特征及形式。通過外周管分別微電泳不同的受試藥物，包括微電泳不同濃度神經內分泌生物活性肽UCN及CRF-2R阻斷劑AST，微電泳為電流40 nA，滯流的阻力電流為10 nA，微電泳時程20 s，記錄UCN及CRF-2R阻斷劑對STN 神經元放電影響。微電泳UCN過程中給予AST，監測UCN及CRF-2R之間的關系。

1.5生物肽UCN對STN內的DA能、GLU能神經傳遞的影響6個外周管實驗前1 h灌注GLU及NMDA阻斷劑MK-801，把GLU微電泳入STN神經元，觀察STN 內的神經元自發放電的變化，于微電泳GLU的41～60 s，微電泳20 s UCN，于微電泳GLU的81～100 s之間微電泳AST，20 s。監測UCN對STN 內GLU能神經傳遞的影響。同上述方法，把DA及其受體阻斷劑CPM微電泳入STN神經元，監測STN 神經元放電的變化，于微電泳DA的41～60 s、81～100 s之間，分別微電泳UCN和CRF-2R阻斷劑AST 各20 s，監測UCN對STN 內DA 能神經傳遞的影響。最后，在微電泳CRF-2R阻斷劑AST-2B、PKA及其阻斷劑H-89，觀察UCN對STN中神經元影響的可能信號機制。

2 結果

2.1STN神經元自發放電情況共定位并成功觀察到STN神經元58個，觀察受試STN神經元的放電波形及特征。STN神經元放電頻率比較緩慢并且規則，大多為單個神經元放電，為單峰，未見雙向動作電位(action potential, AP)，未見爆發式多棘放電。STN神經元放電頻率一般在0～8 Hz之間。

2.2神經肽UCN及AST對STN神經元放電影響本部分實驗中共觀察STN神經元33個。將UCN(10-6mol·L-1, 20 nA，20 s)微電泳入受試的STN神經元，81.81%(27/33)STN神經元自發放電頻率被降低，對18.19%(6/33)STN神經元無明顯改變。上述33個被觀察的STN神經元的平均放電頻率由微電泳前的(3.65±0.27)Hz減少至(2.05±0.33)Hz，給予UCN前、后STN神經元放電頻率降低，差異具有顯著性(P<0.01)。此外，選擇對UCN產生抑制作用的STN神經元24個，給予AST(10-6mol·L-1, 20 nA，20 s)，實驗中發現79.17%(19/24)STN的放電頻率被CRF-2R阻斷劑AST明顯升高，由(3.45±0.36)Hz升高至(5.55±0.47)Hz(P<0.01)。選取對UCN產生抑制效應的上述STN神經元中的20個，微電泳UCN(20 nA，40 s)過程中給予AST(20 nA，20 s)，實驗中發現UCN的抑制效應被AST拮抗，差異具有顯著性(P<0.01)，可翻轉85%(17/20)STN神經元的抑制效應，頻率由(2.11±0.34)Hz增加至(5.45±0.53)Hz。見Fig 1。

Fig 1 Effect of UCN on STN neuron’s spontaneous discharge

AST was used during the period of 21th-40th s in UCN.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsUCN group.

2.3UCN及AST對STN中抑制性DA神經傳遞的影響在本部分實驗中，觀察了對DA產生抑制效應的STN神經元共計21個。發現DA(20 nA，20 s)可使正常的STN神經元產生抑制效應，拮抗STN神經元的正常自發放電波形及頻率。STN放電頻率由(3.45±0.55)Hz降低至(2.17±0.32)Hz，該實驗數據差異具有顯著性(P<0.01)。然后，選取上述對DA產生抑制效應的21個STN神經元，于微電泳DA 的21～40 s之間，外周管微電泳UCN(20 nA，20 s)，發現71.42%(15/21)STN中的DA神經元的放電頻率進一步下降，放電頻率由(2.17±0.32)Hz明顯減少至(1.45±0.29)Hz，(P<0.05)。最后，在微電泳DA的61～80 s之間，由外周管同時微電泳AST(20 nA，20 s)，使原本抑制的76.19%(16/21)STN中DA神經元放電頻率明顯增加，放電頻率由 (1.65±0.27)Hz增加至(4.52±0.68)Hz，該實驗數據差異具有顯著性(P<0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Effects of UCN on DA-ergic neuron in STN

A: UCN affected DA-ergic neuron in STN. UCN and AST were used to observe the effects of UCN on DA; B: The effects and wave of UCN on STN’s DA-ergic neurons.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsDA group.

2.4UCN及AST對STN中興奮性GLU神經傳遞的影響在本部分實驗中，觀察對GLU產生興奮效應的STN神經元共計18個。由外周管微電泳GLU(20n A，20 s)，77.78%(14/ 18)STN神經元產生興奮效應，其自發放電頻率明顯加快，差異具有顯著性(P<0.01)。然后，選擇上述對GLU產生興奮效應的14個STN神經元，在21～40 s之間由外周管微電泳UCN(20 nA，20 s)，STN中的78.57%(11/14)的GLU能放電頻率明顯減少(P<0.01)，放電頻率由(5.67±0.48)Hz減少至(2.93±0.77)Hz。最后，選用對GLU產生興奮效應的GLU能神經元14個，在微電泳GLU的61～80 s，于外周管微電泳CRF-2R阻斷劑AST(20 nA，20 s)，AST可明顯增加STN神經元放電頻率(P<0.05)，放電頻率由(5.65±0.38)Hz增加至(6.65±0.47)Hz，見Fig 3。

Fig 3 Effects of UCN on glu-ergic neuron in STN

A: UCN affected GLU-ergic neuron in STN. UCN could inhibit the excited effects of GLU and AST could excited GLU in STN; B: The effects and wave of UCN on STN’s GLU-ergic neurons.**P<0.01vsnormal group;#P<0.05,##P<0.01vsGLU group.

2.5UCN對STN神經元中CRF-2R及PKA通路的影響在本研究中，另選擇對PKA產生作用的STN神經元16個，在提前給予PKA通路激動劑后，再給予UCN，UCN可阻斷PKA產生的興奮效應，在21～40 s之間由外周管微電泳UCN(20 nA，20 s)，STN中的75.0%(12/16)的GLU能放電頻率明顯減少(P<0.01)，放電頻率由(4.29±0.37)Hz減少至(3.02±0.33)Hz。在微電泳PKA期間，于外周管微電泳H89(20 s)，PKA 的興奮效應消失，而給予UCN，不能繼續抑制STN神經的放電，放電頻率由微電泳前的(3.06±0.34)Hz變化至(3.03±0.29)Hz。給予CRF-2R阻斷劑AST(20 nA，20 s)，AST也不再增加STN神經元放電頻率，放電頻率變化為(3.07±0.33)Hz(P>0.05)。見Fig 4。

3 討論

本實驗結果表明，神經內分泌生物肽UCN可明顯降低基底神經節中的STN神經元放電頻率及波形，給藥過程中未見爆發式放電，提示UCN抑制STN神經元的放電。然而，CRF-2R阻斷劑AST明顯加快STN神經元的放電頻率，給予AST過程中偶見爆發式放電。另外，微電泳UCN期間同時微電泳AST，AST翻轉UCN的抑制效應，實驗結果進一步提示STN中存在UCN能神經元，并且UCN 與CRF-2R結合后觸發隨后的生物學效應，產生對STN的抑制作用。

Fig 4 Effects of UCN on PKA in STN

A: UCN affected CRF-2R and PKA in STN. During the period of PKA, administrated UCN, PKA and H89; B: The effects and wave of UCN on STN’s PKA and CRF-2R.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01 vs PKA group.

本實驗中的結果進一步證實，DA能在STN的神經傳遞中起抑制效應，而由外周管同時微電泳UCN，UCN協同了DA的抑制效應。相反，AST產生興奮效應，拮抗DA的抑制效應。本實驗結果提示，DA能與UCN在STN的神經元中存在交匯現象。 DA能與UCN都對STN放電產生抑制效應，進一步提示UCN可能在PD等病理情況下，對STN神經元起保護作用，并且這種保護作用是通過與CRF-2R結合而實現的。

本實驗數據證實，GLU能神經投射纖維對STN神經元有明顯的興奮作用，神經生物肽UCN可以拮抗GLU的過度興奮效應，且同時微電泳AST 對GLU興奮效應具有一定協同作用，提示UCN及GLU能在STN中存在匯聚作用，UCN與STN神經元中CRF-2R結合后，拮抗STN中的GLU能神經元的過度興奮毒性。本實驗室既往研究發現，在PD病理情況下，DA能神經元在Bgl中的黑質(substantia nigra, SN)——STR通路中受損，這就使DA的抑制作用減弱，從而使具有興奮效應的神經遞質，如乙酰膽堿能(acetyl choline，ACH)及GLU能等相對占優勢，導致PD的肌張力增強的臨床表現[9-10]。本實驗的結果表明，UCN可以降低GLU能的神經興奮性，降低PD等病理狀態下GLU過度表達所產生的興奮毒性，提示UCN可在PD等疾病中發揮神經保護效應及治療作用。

UCN2與CRF-2R 結合后是如何對STN神經元產生抑制效應的呢？UCN2可能在PD中發揮保護作用機制如何呢？在本實驗研究的最后一部分對機制進行了初步研究。實驗中發現，UCN能抑制PKA所引起的STN神經元的抑制效應，但UCN的抑制作用在給予PKA阻斷劑后，該效應被取消，并且給予CRF-2R阻斷劑后，也不再發揮作用，該實驗結果提示，UCN很可能與CRF-2R 結合后，進而通過激活PKA而引起隨后的生物學效應，阻斷了神經遞質的興奮毒性作用有關。

UCN是CRF肽類家族的一個新型的神經內分泌生物肽，具有抗焦慮、抗糖尿病心肌病變、降血壓、擴血管等多種生理及藥理作用[11-12]。另外，本實驗室既往已經證實，在腦損傷過程中UCN具有神經保護作用，UCN可抑制STR神經元的過度放電，特別是在大鼠嗎啡成癮中減輕大鼠的成癮性，能明顯改善阿片類藥物的成癮及戒斷綜合癥[7, 13-14]，發揮抑制STR神經元過度放電的神經保護作用。但是，UCN是如何發揮其CNS的保護作用的呢？目前，其具體機制尚不明確[14]。在本實驗中，證實UCN與CRF-2R 結合后，發揮抑制STN自發性放電的效應，可能是UCN發揮神經元的保護作用的初始機制，并進一步證實UCN與CRF-2R 結合后觸發了PKA信號通路，這其中可能還涉及其他分子生物學機制，目前仍不明確，應在今后的研究中進一步闡述和證實。本實驗結果表明，UCN通過與CRF-2R結合，進而通過激活PKA，抑制STN神經元放電活動，協同DA的抑制效應，降低STN神經元中GLU的過度興奮性，UCN可能在生理及PD病理情況下發揮CNS保護作用。

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EffectsofneuroactivepeptideurocortinonSTNneuron’sspontaneousdischargeandrelationshipwithCRF-2R

TIAN Fei1, LIU Chun-na2, LIU Xin-yu2, CHEN Qiu-yuan2, DING Yu-hao2

(1.theSecondAffiliatedHospitalofShantouUniversity,ShantouGuangdong515041,China;2.DeptofPharmacology,JinzhouMedicalUniversity,JinzhouLiaoning121000,China)

AimTo investigate the effects of endocrinal petptide urocortin on subthalamic nucleus (STN) neuron’s discharge, also observe the convergence effect of UCN with dopamine (DA) and glutamate (GLU), so as to understand the regulation effects of UCN and its mechanism in Parkinson’s disease (PD).MethodsForty Sprague-Dawley rats were used in this experiment. Nerve electrophysiology method-microiontophoresis was used to observe the effects of UCN on STN neuron firing rates and firing wave. Astressin (AST, the blocker of CRF receptor 2), protein kinase A (PKA) were used to observe the effects of UCN whether via CRF-2R and PKA signal pathway. Moreover, given UCN during the period of DA and GLU, the effects of UCN on DA and GLU in STN neurons were determined.ResultsDuring the period of using the UCN, UCN could inhibit the firing rate of 82% (27/33) STN neuron (P<0.01), and the firing discharge rates were reduced from(3.65±0.27)Hz to (2.05±0.33) Hz (P<0.01). However, the inhibitory effects of UCN in STN could be antagonized by AST. Given UCN during the period of microiontophoresis of inhibitory neurotransmitter (DA) and excited neurotransmitter (GLU), UCN could enhance the effects of DA and attenuate the excitatory effects of GLU (P<0.01).ConclusionUCN and GLU/DA in STN, UCN play inhibitory and regulated effects on STN neurotransmitters(DA and GLU)via CRF-2 receptor and PKA signal pathway.

subthalamic nucleus; dopamine; glutamate; Parkinson’s disease; urocortin; microiontophoresis

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.019

A

：1001-1978(2017)10-1425-06

R-332；R322.81；R338.1；R338.24；R745.702.2；R977.6

時間：2017-9-5 9:26 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.038.html

2017-05-20,

2017-08-25

廣東省醫學科學技術研究基金(No A2015085)；國家大學生創新基金 (No 201610160042)

田 飛(1977-)，男，碩士，副主任醫師，研究方向：神經外科學，E-mail: 30377554@qq.com； 劉春娜(1977-)，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：神經藥理學，通訊作者，Tel：0416-4673465，E-mail: 30377554@qq.com