腦泰方對腦缺血/再灌注大鼠海馬區Nrf2、HO-1和膜鐵轉運輔助蛋白表達的影響

黃 娟，廖 君，彭熙煒，劉 洋，成紹武，秦莉花，鄧奕輝，王國佐，賀 旭,2，葛金文

(1. 湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室, 湖南 長沙 410208；2. 益陽醫學高等專科學校解剖教研室，湖南 益陽 413000)

◇復方藥物藥理學◇

腦泰方對腦缺血/再灌注大鼠海馬區Nrf2、HO-1和膜鐵轉運輔助蛋白表達的影響

黃 娟1，廖 君1，彭熙煒1，劉 洋1，成紹武1，秦莉花1，鄧奕輝1，王國佐1，賀 旭1,2，葛金文1

(1. 湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室, 湖南 長沙 410208；2. 益陽醫學高等專科學校解剖教研室，湖南 益陽 413000)

腦泰方；腦缺血/再灌注損傷；核轉錄因子E2相關因子；血紅素加氧酶-1；膜鐵轉運輔助蛋白；鐵代謝失衡

腦缺血/再灌注損傷機制包括興奮性氨基酸毒性，氧自由基大量生成，細胞內鈣離子超載，線粒體損傷，細胞凋亡和免疫炎癥損傷等[1]。近年來，鐵代謝失衡作為神經系統疾病損傷機制研究受到廣泛關注[2]。我們課題組前期研究表明，鐵調節失衡可能是導致腦缺血神經元損傷的新機制，而腦泰方(Naotai formula extract，NTE)可通過調節鐵轉運相關蛋白的表達，抑制鐵的細胞內轉運，促進胞內鐵外排，達到保護神經元，促進神經功能恢復的作用[3-5]。氧自由基是導致缺血/再灌注損傷機制之一[6]。神經退行性疾病中線粒體內鐵聚集導致氧化應激損傷[7]，Liu 等[8]提出氧化應激在缺血/再灌注損傷中扮演重要角色，血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是重要的血紅素降解酶，具有抗炎抗凋亡作用。因此，我們推測鐵代謝失衡可能是腦缺血/再灌注損傷的新機制，本研究擬探討腦缺血/再灌注大鼠海馬組織核轉錄因子E2相關因子(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2)、HO-1和膜鐵轉運輔助蛋白(hephaestin，Heph)的表達及腦泰方發揮保護作用的具體機制。

1 材料

1.1實驗動物Sprague-Dawley(SD)♂大鼠80只，體質量250 ～280 g，SPF級，8周齡。由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號: SCXK(湘)2013-0004，動物合格證號：43004700023825。動物飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，濕度45%～65%、室溫25℃、自由飲水、攝食，適應性飼養 1 周后開始實驗。

1.2藥物腦泰方組方由黃芪、川芎、地龍和僵蠶四味藥組成。黃芪主要成分為黃芪甲苷，具有抗腦缺血/再灌注損傷及氧化應激等作用；川芎的主要成分為川芎嗪，具有保護血管內皮、抗缺血/再灌注損傷、抗氧化應激等作用；地龍提取液具有抗氧自由基、脂質過氧化、炎性因子損傷作用；僵蠶提取物具有抗凝、抗血栓、促纖溶等作用。藥材均購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院。藥材經水煎、醇提后制成浸膏粉(由湖南中醫藥大學藥學院制劑教研室提取)，臨用時以生理鹽水調成所需濃度。

1.3儀器與試劑Real-Time PCR儀(7500，ABI)；凝膠成像分析系統、電泳槽(Bio-Rad)。逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)；Nrf2多克隆抗體(批號：sc-722)、HO-1多克隆抗體(批號:sc-1796)、Heph多克隆抗體(批號:sc-49969S)均購自Santa Cruz；PVDF膜(Millipore公司)；ECL化學發光試劑盒(GE Healthcare)；去鐵酮(加拿大奧貝泰克制藥有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(上海如吉生物科技有限公司)；水合氯醛(國藥集團)；線栓(2636 A4，北京西濃)。2方法

2.1分組及給藥方法隨機數字表法將80只大鼠分為5組，每組16只，分別為假手術組(Sham，灌胃生理鹽水)、模型組(I/R，灌胃生理鹽水)、腦泰方低、中、高劑量組(NTE+I/R, 灌胃劑量分別是4.5、9、18 g·kg-1) 。藥物劑量按公式計算：大鼠劑量/g=成人每日劑量(g)×大鼠體重與體表面積比值/人體重與體表面積比值[9]。每只大鼠術前灌胃3 d、術后灌胃2 d，每日1次，于術后d 3處死取材。

2.2動物造模采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型[10]。阻塞右側大腦中動脈2 h后拔出線栓，造成腦缺血/再灌注模型，假手術組只分離血管，不插入線栓。麻醉清醒后，采用神經行為學評分判斷模型是否成功。

2.3指標檢測

2.3.1神經行為學評分 大鼠缺血/再灌注后72 h評分，采用Zea Longa等[11]制定5級4分制評分標準。0 分：無神經損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向對側轉圈；3 分：向對側傾倒；4 分：不能自發行走，意識喪失；分值越高，說明動物行為障礙越嚴重。

3 結果

3.1神經行為學評分結果缺血/再灌注后72 h，與假手術組比較，模型組神經行為學評分明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，NTE中、高劑量組神經行為學評分明顯降低(P<0.01)，NTE低劑量組與模型組比較差異無顯著性(P>0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effects of Naotai formula extract (NTE) on neurologicaldeficit scores of I/R in rats (±s, n=16)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R

3.2TTC染色結果TTC染色后，與假手術組比較，模型組呈現較大梗死面積(P<0.01)；與模型組比較，NTE各劑量組梗死范圍明顯縮小(P<0.01)，見Fig 2。

Fig 2 Effects of naotai formula extracton infarct volume of I/R in rats(±s,n=6)

A:Coronal sections of 2,3,5-triphenyltetrazolium-stained brains；B：Infarct volume.**P<0.01vssham;##P<0.01vsI/R.

3.3Real-timePCR檢測結果與模型組比較，各NTE劑量組HO-1 mRNA表達明顯增加(P<0.05)，NTE中、高劑量組Heph mRNA 表達明顯增加(P<0.05)。各NTE劑量組中Nrf2 mRNA表達增高，但與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。 見Fig 3。

Fig 3 Effects of naotai formula extract on hippocampus Nrf2(A), HO-1 (B) and Heph (C) mRNA levels of I/R in rats(±s, n=5)

#P<0.05vsI/R

3.4Westernblot檢測結果假手術組中Nrf2、HO-1和Heph蛋白呈少量表達，模型組中Nrf2蛋白表達增加，HO-1和Heph蛋白表達降低，但與假手術組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。各NTE組能不同程度上調Nrf2、HO-1和Heph蛋白表達，其中NTE中、高劑量組Nrf2和Heph蛋白的表達明顯高于模型組(P<0.05，P<0.01)；各NTE劑量組HO-1的表達較模型組明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01)。見Fig 4。

Fig 4 Effects of naotai formula extract on hippocampus Nrf2(A), HO-1(B) and Heph (C) protein levels of I/R in rats(±s, n=5)

#P<0.05，##P<0.01vsI/R

4 討論

腦缺血/再灌注后因自由基大量生成、興奮性氨基酸毒性、鈣超載及炎癥反應等原因導致腦損傷[12-13]。近年來也有研究表明，腦缺血/再灌注損傷與自噬、鐵代謝等相關。腦缺血/再灌注后鐵過載的兩條途徑： IL-6表達上調，激活JAK/STAT3通路使鐵調素增加，而鐵調素可以使膜鐵轉運蛋白表達下降，因此鐵外排減少，造成鐵沉積；再灌注后低氧誘導因子-1α表達上調，使轉鐵蛋白受體增加，導致鐵在缺血組織中的沉積[14]。腦缺血/再灌注后腦鐵超載能通過氧化損傷或直接的神經毒性等機制加重神經損傷，引起細胞鐵死亡[15]。

Keap1-Nrf2/ARE信號通路在抗氧化應激損傷中發揮重要的作用。在生理狀態下，Nrf2與果蠅肌動蛋白結合蛋白(Keap1)結合位于胞質中，從而不能進入細胞核發揮轉錄活性。當受到氧化應激時，Nrf2與Keap1解離進入細胞核，與抗氧化反應組件ARE結合，從而啟動下游抗氧化基因和 HO-1 的轉錄，提高細胞的的抗氧化應激能力。 Keap1-Nrf2/ARE通路可以靶向調節與鐵代謝密切相關的蛋白，如鐵蛋白和膜鐵轉運蛋白，從而進一步調節機體鐵代謝[16]。HO-1作為一種與鐵代謝相關的應激蛋白，HO-1可以將血紅素分解成為膽綠素、CO和鐵，應激狀態下能對抗氧化應激起到保護作用，而慢性過表達時可以促使鐵沉積，通過Fenton反應，生成毒性更大的羥自由基[17]。Heph在皮質、紋狀體、海馬、黑質、腦干等部位均有表達[18]，在腦鐵代謝中發揮重要的作用。Heph屬于鐵轉運相關蛋白，具有亞鐵氧化酶活性，能將二價鐵氧化成三價，與膜鐵轉運蛋白共同調節鐵釋放，減輕鐵過載誘發的氧化損傷。已有研究報道，大鼠腦缺血/再灌注后損傷區Nrf2 表達迅速上調，而再灌注后3～72 h各時間點，Nrf2蛋白的表達變化不明顯；HO-1蛋白的表達在48 h達高峰，在72 h逐漸下降[19]。 缺血/再灌注后12 h皮層和紋狀體中Heph蛋白表達明顯增加，在24 h達到峰值，在72 h恢復到正常水平[20]。腦缺血/再灌注后Keap1-Nrf2/ARE信號通路激活，急性期HO-1及Heph表達增加可減少氧化應激損傷，這是一種保護性應激反應，但是反應持續時間短，因此需要藥物干預缺血/再灌注損傷。腦缺血后，中藥補陽還五湯精簡方干預可以上調Nrf2和HO-1蛋白和基因的表達，明顯改善其神經功能缺失癥狀，減小腦梗死面積，減輕腦組織水腫[21]。黃芪與三七有效成分配伍作用腦缺血/再灌注后小鼠，單用黃芪甲苷組能降低胞質Nrf2蛋白含量，胞核內Nrf2表達升高，同時上調HO-1 mRNA和蛋白表達，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的效應最明顯[22]。本研究中腦缺血/再灌注后腦泰方干預，腦泰方各劑量組神經行為學評分較模型組降低，大鼠神經功能得到改善，腦梗死體積縮小，缺血/再灌注損傷的海馬組織 HO-1和Heph mRNA及蛋白表達均上調， Nrf2蛋白表達增高，而Nrf2 mRNA表達上調不明顯，這與蛋白表達不相一致，提示Nrf2調控并非發生于基因轉錄水平，可能是因為Nrf2轉錄活性增強而mRNA表達無明顯改變[23]。

因此，我們推測細胞內鐵代謝失衡是腦缺血/再灌注損傷的機制，腦泰方可能通過激活Keap1-Nrf2/ARE通路，促進HO-1 和Heph表達，促進鐵外排，降低腦鐵沉積，抑制鐵離子介導的氧化應激損傷，具有平衡鐵代謝，保護神經元，恢復神經功能的作用。

(致謝：本實驗主要在湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室完成，感謝實驗室及課題組老師和同學的幫助。)

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EffectsofNaotaiformulaonexpressionofNrf2,HO-1andhephaestininhippocampusofcerebralischemia/reperfusionrats

HUANG Juan1, LIAO Jun1, PENG Xi-wei1, LIU Yang1, CHENG Shao-wu1, QIN Li-hua1, DENG Yi-hui1, WANG Guo-zuo1, HE Xu1,2, GE Jin-wen1

(1.KeyLabofHunanProvinceforIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineonPreventionandTreatmentofCardio-CerebralDiseases,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China; 2.DeptofAnatomy,YiyangMedicalCollege,YiyangHunan413000,China)

AimTo investigate the effects of Naotai formula extract(NTE)on the expression of heme oxygenase-1(HO-1) and hephaestin(Heph) in hippocampus of rats after cerebral ischemia/reperfusion by Keap1-Nrf2/ARE signaling pathway.MethodsEighty rats were randomly divided into five groups as follows: sham operation group(Sham), cerebral ischemia/reperfusion group(I/R), low dose group of NTE(4.5 g·kg-1), middle dose group of NTE (9 g·kg-1) and high dose group of NTE(18 g·kg-1). Rats were pretreated by intragastric administration for three consecutive days, and then subjected to middle cerebral artery occlusion (MCAO) 2 hours before reperfusion. The rats were administered with intragastric administration for two days. After cerebral ischemia reperfusion 72 hours, the behavioral activity of rats was recorded by Zea Longa neurological score, and the infarct volume was measured by TTC staining. The expressions of Nrf2, HO-1 and Heph in hippocampus of cerebral ischemia reperfusion rats were observed by real-time quantitative PCR and Western blot, respectively.ResultsCompared with model group, the neurobehavioral scores significantly decreased in NTE high-dose and middle-dose groups (P<0.01); the infarct volume of NTE groups markedly decreased (P<0.01); the expression of HO-1 mRNA apparently increased (P<0.05) in NTE groups; the expression of Heph mRNA significantly increased in NTE middle-dose and high-dose groups (P<0.05); the expression of Nrf2 and Heph protein evidently increased in the NTE middle and high dose groups (P<0.05,P<0.01); and the expression of HO-1 protein also increased in NTE groups(P<0.01).ConclusionsNaotai formula can relieve cerebral ischemia-reperfusion injury. The mechanism might be associated with activating Keap1-Nrf2/ARE signaling pathways, promoting HO-1 generation, advancing the expression of Heph, and then reducing brain iron deposition, to achieve the protection of neurons after cerebral ischemia-reperfusion.

Naotai formula extract(NTE); cerebral ischemia-reperfusion injury; nuclear factor-erythroid 2 related factor; heme oxygenase-1; hephaestin; iron metabolism imbalance

：目的研究益氣活血中藥腦泰方通過Keap1-Nrf2/ARE信號通路對腦缺血/再灌注后大鼠海馬區血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和膜鐵轉運輔助蛋白(hephaestin，Heph)表達的影響。方法將80只♂大鼠隨機分為假手術組、模型組、腦泰方低劑量組(4.5 g·kg-1)、中劑量組(9 g·kg-1)和高劑量組(18 g·kg-1)。各組大鼠術前連續灌胃給藥3 d，每日1次，再行大腦中動脈線栓法腦缺血/再灌注模型制備術，術后連續灌胃給藥2 d。術后72 h采用Zea Longa神經功能學評分標準記錄大鼠行為活動，TTC染色法測定腦梗死體積，real-time PCR檢測大鼠海馬區Nrf2、HO-1、Heph的mRNA表達，Western blot檢測 Nrf2、HO-1、Heph的蛋白表達。結果與模型組比較，腦泰方中、高劑量組的神經行為學評分明顯下降(P<0.01)，各腦泰方組腦梗死體積明顯縮小(P<0.01)；HO-1 mRNA表達均增加(P<0.05)。腦泰方中、高劑量組Heph mRNA表達增加(P<0.05)；Nrf2和Heph蛋白表達明顯增加(P<0.05，P<0.01)。各腦泰方組HO-1蛋白表達增高(P<0.01)。結論腦泰方能減輕腦缺血/再灌注損傷，其機制可能是通過激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路，促進HO-1生成，上調Heph的表達，減少腦鐵沉積，發揮腦缺血/再灌注后神經元的保護作用。

時間：2017-9-5 9:26 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.054.html

2017-05-16,

2017-08-20

國家自然科學基金資助項目(No 81303078)；湖南省科技廳重點項目(No 2014SK2007)；湖南省教育廳優秀博士學位論文獲得者科研項目(No YB2016B030)；湖南省研究生科研創新項目(No CX2015B331)

黃 娟(1991-)，女，碩士生，研究方向：心腦血管疾病的中西醫結合防治，E-mail：674630362@qq.com； 廖 君(1978-)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：腦缺血的中醫藥防治，通訊作者，E-mail：84085006@qq.com； 葛金文(1964-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心腦血管疾病的中西醫結合防治，通訊作者，E-mail：40831556@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.027

A

：1001-1978(2017)10-1467-06

R-332；R282.71；R322.81；R743.310.22；R977.3；R977.6