水稻硝酸鹽轉運蛋白基因OsNPF7.9在氮素積累和轉運中的功能研究

馮慧敏 陸宏 王漢卿 李昕玥

(南京農業大學 資源與環境科學學院，南京 210095；*通訊聯系人，E-mail：huimin.feng@njau.edu.cn)

水稻硝酸鹽轉運蛋白基因OsNPF7.9在氮素積累和轉運中的功能研究

馮慧敏*陸宏 王漢卿 李昕玥

(南京農業大學 資源與環境科學學院，南京 210095；*通訊聯系人，E-mail：huimin.feng@njau.edu.cn)

【目的】植物NPF家族成員具有轉運硝酸鹽、小肽等的功能。對水稻OsNPF7.9基因的功能研究能夠為水稻氮素高效利用的分子機制提供理論基礎。【方法】利用不同的生物軟件對OsNPF7.9蛋白的生物學信息進行了預測分析；用OsNPF7.9基因啟動子融合GUS報告基因的轉基因水稻進行OsNPF7.9的組織定位觀察；利用半定量RT-PCR和pOsNPF7.9::GUS轉基因水稻分析OsNPF7.9受氮素調控特征；構建了OsNPF7.9的超表達水稻株系，并進行生理指標測定。【結果】OsNPF7.9是細胞質膜蛋白，有12個跨膜結構域，在第6～7個結構域之間有一個大的親水環。組織定位結果顯示OsNPF7.9在根、葉片、根莖結合處和花中都有表達。RT-PCR和pOsNPF7.9::GUS轉基因水稻的GUS染色結果都表示，OsNPF7.9的表達不受氮素形態和濃度的影響。OsNPF7.9基因超表達后，不僅顯著增加水稻的地上部硝酸鹽含量以及根系向地上部的硝酸鹽轉運，而且增加了地上部的總氮濃度、總氮積累以及根系向地上部的總氮轉運。【結論】OsNPF7.9參與硝酸鹽從根系向地上部的轉運，并且OsNPF7.9超表達可以提高水稻氮素積累和轉運能力。

水稻；氮素；OsNPF7.9；硝酸鹽轉運蛋白

水稻是重要的糧食作物，氮素是植物生長發育必需的大量營養元素之一。在我國，低氮肥利用造成大量氮肥流失，進而帶來嚴重的環境問題。水稻基因組測序完成，為水稻功能組學的研究提供有力的生物信息學背景[1-3]。因此，開展水稻氮素高效利用的分子機制研究，進而培育水稻氮素高效利用的品種有著重大的意義。

植物根系從土壤中吸收的礦質氮源主要有銨態氮(NH4+)和硝態氮(NO3－)。植物NO3－運輸系統分為高親和系統(HATS)和低親和系統(LATS)[4-5]，這兩個系統都由NO3－轉運蛋白來執行。NPF(原名為NRT1/PTR)以及NRT2/NAR2(NAR2是NRT2的輔助蛋白)家族編碼NO3－轉運蛋白，其中，NRT1負責LATS硝酸鹽的吸收和轉運，PTR負責轉運含氮化合物比如寡肽和氨基酸，NRT2/NAR2家族成員負責HATS硝酸鹽的吸收和轉運[6-7]。擬南芥和水稻NPF家族分別有53和80多個成員，NPF家族中的很多基因的功能已經得到鑒定[7-8]。在擬南芥中，AtNPF6.3(AtCHL1/AtNRT1.1)屬于雙親和NO3－轉運蛋白，也是響應NO3－信號的受體[8-13]。AtNPF7.3(AtNRT1.5)負責NO3－從根部向地上部運輸，而且和逆境的響應有關[14-15]；AtNPF7.2 (AtNRT1.8)參與NO3－木質部運輸，調節擬南芥對鎘的耐性[16]。此外，AtNPF3.1被發現能夠轉運亞硝酸鹽和赤霉素(GA)[17-19]。OsNPF8.2 (OPTR9)超表達后促進水稻生長，提高水稻氮素利用效率和產量[20]；OsNPF2.4和OsNPF2.2參與NO3－從根系向地上部運輸[21-22]；OsNPF7.2被定位在液泡膜， OsNPF7.2敲除導致水稻在外界高NO3－條件下生長受阻[23]。目前，有關其他水稻OsNPF成員的研究還尚未見報道。

水稻OsNPF7.9的功能研究未有報道。我們從水稻日本晴中克隆了OsNPF7.9的啟動子序列和ORF序列，并通過不同的方法研究了OsNPF7.9蛋白的跨膜結構和亞細胞定位，OsNPF7.9基因的表達特征和組織定位，以及OsNPF7.9超表達水稻的硝酸鹽吸收轉運的生理特征，以期為進一步研究OsNPF7.9參與水稻氮素高效利用的分子機制提供理論基礎和有效指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料武運粳7號為本實驗繁種保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 進化樹和跨膜結構分析

NPF家族基因進化樹繪制：在Aramemnon上(http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/index.ep)及NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中找出已明確基因功能的NPF家族成員的氨基酸序列，通過Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/)在線軟件的聚類比較，再由MEGA5.1軟件繪制完成NPF家族基因進化樹，最后用軟件iTOL美化進化樹(http://itol.embl.de/)。

利用HmmTop_v2在線(http://www.enzim.hu/ hmmtop/html/submit.html)分析OsNPF7.9的跨膜結構，并運用TMRPre2D(http://biophysics.biol.uoa.gr/ TMRPres2D/download.jsp)繪制跨膜結構圖。

1.2.2 亞細胞定位

根據OsNPF7.9基因序列(LOC_Os02g46460)和構建eGFP融合表達載體的規則設計PCR引物(金斯瑞公司合成)，上游引物序列5＇-AAAGCTTGAG CAAGAAATGTCTGGAACG-3＇，下游引物序列為5＇-AGAATTCCTTGTCGTGCTAAACC-3＇，引物兩端酶切位點分別為SpeⅠ和SacⅠ。水稻cDNA為模板擴增基因，連到克隆載體pMD19-T(TaKaRa公司)上，經過測序驗證正確后用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TaKaRa公司)將目的片段切下來分別連接到中間載體pSAT6-EGFP-N1上，經驗證正確后用限制性內切酶PI-PspⅠ將含有eGFP基因和OsNPF7.9的DNA片段切下來連接到表達載體pRCS2-ocs-nptⅡ，即為OsNPF7.9::eGFP。提取水稻原生質體和轉化[24]，將5 μg的OsNPF7.9::eGFP載體質粒加入200 μL原生質體中，12～16 h后，先用膜蛋白染料FM?4-64給原生質體染色2 min，然后利用激光共聚焦顯微鏡(Leica SP8)分別在560 nm波長和450～490 nm波長下激發膜蛋白染料和eGFP發出熒光，拍照記錄。

1.2.3 pOsNPF7.9::GUS轉基因水稻獲得及組織定位觀察

根據OsNPF7.9啟動子序列設計引物，上游引物序列5＇-TTAATTAAATCTCTAAGGGACTAA CACA-3＇，下游引物序列5＇-GGCGCGCCCATTTC TTGCTCCTCCTCG-3＇，引物兩端酶切位點分別為PacⅠ和AscⅠ。以水稻gDNA為模板，擴增出一段長1651 bp的啟動子，并將啟動子連接到克隆載體pMD19-T上，經測序驗證序列完全正確后將啟動子連接到表達載體PS1aG-3上，形成載體pOsNPF7.9::GUS。將pOsNPF7.9::GUS載體轉入農桿菌，用農桿菌浸染法轉入日本晴水稻基因組中，參考Ai等[25]的方法，獲得T1代水稻種子。

種子發芽后，用正常營養液培養10 d，苗期取根系、葉片和根莖結合處；將水稻苗用土壤培養至抽穗揚花期，取花器官。采樣后立即將樣品浸入GUS染液，37℃培養箱過夜，在體式顯微鏡下觀察拍照。葉片用70%酒精脫色后再觀察拍照。

表1 本研究所用的半定量RT-PCR引物序列Table 1. Primers for semi-RT PCR in the study.

1.2.4 半定量PCR檢測基因表達

提取水稻總RNA，經反轉錄成cDNA(TaKaRa公司反轉錄試劑盒)，用OsNPF7.9基因和OsActin半定量引物擴增，引物序列、退火溫度和循環數列于表1。

1.2.5 OsNPF7.9超表達水稻獲得及分子檢測

根據OsNPF7.9 ORF序列設計引物，上游引物序列為5＇-AACTAGTGAGCAAGAAATGTCTGGA ACG-3＇，下游引物序列5＇-AGAGCTCCGGAGAC TTGTCGTGCTAAACC-3＇，引物兩端酶切位點分別為SpeⅠ和SacⅠ。連到克隆載體pMD19-T (TaKaRa公司)上，經過測序驗證后將目的片段酶切下來分別連接到表達載體pTCK303，測序正確后，將載體轉入農桿菌，用農桿菌浸染法轉入武運粳7號基因組中，轉基因方法參考Ai等[25]，獲得T1代種子。將T1代連續繁種獲得T3代植株，提取水稻gDNA，用Southern印跡法[24]檢測插入基因的拷貝數。提取T3代植株總RNA，半定量RT-PCR檢測OsNPF7.9基因的表達，參考步驟1.2.4。

1.2.6 水稻培養

水稻種子武運粳7號野生型及T4代轉基因株系OE1和OE2，經15% H2O2消毒30 min，蒸餾水洗凈后放入37℃培養箱黑暗培養3 d催芽，到第2葉完全展開時，移入含有50 mg/L潮霉素的水溶液中篩選1周，再挑選長勢良好、形態一致的苗，移至6 L的周轉箱，每箱12穴，每穴2株苗，用IRRI營養液 (1.25 mmol/L NH4NO3, 0.35 mmol/L K2SO4, 1 mmol/L CaCl2·2H2O, 1 mmol/L MgSO4·7H2O, 0.5 mmol/L Na2SiO3·9H2O, 20 mmol/L Fe-EDTA, 20 mmol/L H3BO3, 9 mmol/L MnCl2·4H2O, 0.32 mmol/L CuSO4·5H2O, 0.77 mmol/L ZnSO4·7H2O, 0.39 mmol/L Na2MoO4·2H2O) 培養，調pH值為5.5，每3 d更換一次。每組實驗每個株系3個技術重復，2次生物學重復。

將水稻植株放進105℃烘箱殺青30 min，75℃下烘干至恒重，粉碎后稱取0.05 g樣品，用H2SO4-H2O2法對樣品進行消化后使用流動分析儀(型號為AA3)測定樣品中的總氮。取水稻植株干樣0.03 g置于10 mL離心管中，加5 mL去離子水后將裝有樣品的離心管放在100℃沸水中煮30 min，等試管中的溶液冷卻后吸取1 mL上清稀釋到10 mL，用AA3型連續性流動分析儀測溶液中NO3－-N的含量。

2 結果與分析

2.1 植物NPF家族成員進化樹分析

OsNPF7.9位于水稻第2染色體上，cDNA全長序列為2240 bp，編碼610個氨基酸，有5個外顯子和4個內含子。在植物中，有約45個NPF成員已被報道有硝酸鹽、亞硝酸鹽、小肽或者激素轉運的功能[6-8]。利用生物學軟件Clustal Omega和MEGA5.1對水稻、擬南芥、黃瓜和苜蓿等植物的這45個NPF成員進行進化樹分析(圖1)。結果發現水稻的OsNPF7.9與擬南芥的AtNPF7.2 (AtNRT1.8)和AtNPF7.3(AtNRT1.5)進化關系最密切。在水稻OsNPF家族成員中，OsNPF7.9與OsNPF7.1、OsNPF7.2、OsNPF7.3(OsPTR6)和OsNPF7.4 (OsPTR5)進化關系較密切。

2.2 OsNPF7.9亞細胞水平定位分析

跨膜結構預測軟件分析結果表明(圖2)，OsNPF7.9蛋白含有12次跨膜域，N端在細胞內，而且在第6和第7跨膜結構域之間有一個由99個氨基酸組成的親水環。為了進一步確認OsNPF7.9的亞細胞定位，將OsNPF7.9融合GFP蛋白，并轉化水稻原生質體。圖3結果顯示，陽性對照eGFP表達在整個細胞中，而OsNPF7.9和GFP的融合蛋白只表達在細胞質膜上，而且與膜定位染料FM64

結果完全重合，表明OsNPF7.9定位在細胞質膜上。

圖1 植物NPF家族進化樹分析Fig. 1. Phylogenetic of NPF in plants.

2.3 OsNPF7.9在不同組織中的表達

為研究OsNPF7.9在不同組織中的表達，構建了OsNPF2.4啟動子融合GUS報告基因的載體，并得到轉基因水稻pOsNPF2.4::GUS。將14 d大小的轉基因水稻幼苗不同部位進行GUS染色檢測，發現OsNPF2.4在根尖沒有GUS表達(圖4-A)，主要在主根成熟區和側根有強烈GUS表達(圖4-B)，同時在葉片和根莖結合處檢測到GUS活性(圖4-C,D)；OsNPF7.9在花藥和種子外殼的盾片上也有表達(圖4-E，F)。

2.4 OsNPF7.9在不同形態氮素下的表達水平

為了研究OsNPF7.9受氮素調控模式，將水稻幼苗缺氮后分別供應0.2 mmol/L NO3－、5 mmol/L NO3－、0.2 mmol/L NH4+和5 mmol/L NH4+，結果顯示，在根部OsNPF7.9的表達水平不受氮素形態和濃度的調控(圖5-A)。對pOsNPF7.9::GUS轉基因水稻進行不同氮素形態和濃度的處理，和RT-PCR結果一致，轉基因水稻根系的GUS活性不受氮素形態和濃度的影響(圖5-B)。

2.5 OsNPF7.9超表達水稻的獲得和分子鑒定

通過轉基因手段將pUbi-OsNPF7.9轉化日本晴，得到了OsNPF7.9的超表達轉基因水稻苗60株，經過GUS染色和PCR擴增鑒定，30株轉基因苗是陽性苗，轉基因苗的陽性率為50%。從中隨機挑選兩個株系，命名為OE1和OE2，用OsNPF7.9特異的半定量引物對野生型和超表達株系mRNA水平進行分析，發現OE1和OE2的表達水平都顯著提高(圖6-A)。Southern blot結果表明，OE1和OE2是插入位點不同的兩個單拷貝株系(圖6-B)。

圖2 OsNPF7.9跨膜結構分析Fig. 2. Transmembrane topology of OsNPF7.9.

圖3 OsNPF7.9水稻原生質體亞細胞定位Fig. 3. Sub-celluar localization of OsNPF7.9 in rice protoplast.

圖4 OsNPF7.9啟動子融合GUS轉基因水稻的組織定位Fig. 4. Tissue expression of pOsNPF7.9::GUS transgenic rice.

2.6 OsNPF7.9超表達對水稻生長和硝酸鹽吸收轉運的影響

為了研究OsNPF7.9過表達后對水稻生長、硝酸鹽吸收和轉運的影響，我們將OE1和OE2在含有1.25 mmol/L NH4NO3的營養液中培養30 d。結果發現，OE1和OE2地上部長勢優于野生型水稻(圖 7-A)，進一步結果顯示(圖7-B)，兩個超表達株系地上部的干質量比野生型增加約31%和27%，而地下部沒有顯著差異。如圖7-C顯示，與野生型相比，超表達株系OE1和OE2地上部NO3－濃度分別提高了26%和17%，但是地下部分別降低了17%和19%。通過計算地上部和地下部含量的比值發現，與野生型相比，OE1和OE2的比值都顯著提高(圖7-D)。這表明OsNPF7.9超表達可以促進地上部的生長，并且OsNPF7.9超表達雖然降低了根系NO3－含量，但是提高了水稻從根系向地上部的轉運，進而提高了地上部量。

圖5 OsNPF7.9在不同形態氮素和不同濃度下的表達Fig. 5. Expression of OsNPF7.9 supplied with various forms of nitrogen at different N concentrations.

圖6 OsNPF7.9超表達水稻的分子鑒定Fig. 6. Identification of OsNPF7.9-overexpressing rice.

2.6 OsNPF7.9超表達對水稻氮素積累和轉運的影響

進一步測定超表達株系和野生型的總氮，如圖8-A顯示，和野生型相比，OE1和OE2在地上部的總氮濃度顯著提高，而地下部沒有顯著差異。根據干質量和總氮濃度計算得到的總氮積累，OE1和OE2和總氮積累比野生型高55%和60%(圖8-B)。同時，OE1和OE2地上部和地下部總氮積累的比率與野生型相比顯著提高(圖8-C)。這說明OsNPF7.9超表達不僅對維持水稻生長具有重要作用，而且能夠提高水稻氮素積累和轉運。

3 討論

水稻OsNPF家族中有80個成員基因，迄今為止已報道了多個基因具有參與硝酸鹽或者小肽的轉運的功能[6,8]。本研究中，OsNPF7.9與擬南芥AtNPF7.2和AtNPF7.3在進化樹上的親緣關系較近(圖1)，AtNPF7.2和AtNPF7.3已被發現具有硝酸鹽轉運的功能[14,16]。

圖7 OsNPF7.9超表達水稻的生長和含量Fig. 7. Growth andconcentration in the OsNPF7.9 overexpressing rice.

植物NPF家族蛋白一般由450～600個氨基酸構成，有12次跨膜結構域，并且在第6～7個跨膜結構域之間有一個大的親水環[26,27]，而OsNPF7.9的跨膜結構具有NPF家族蛋白的特征(圖2)。已有研究發現AtNPF7.2和AtNPF7.3是細胞質膜蛋白[14,16]，我們將OsNPF7.9定位于細胞質膜上(圖3)。

OsNPF7.9在根系的表達不受氮素形態和濃度的調控(圖5)，屬于組成型表達。在水稻中，有些NPF家族成員都顯示不受氮素形態和濃度的調控，如OsNPF8.9(OsNRT1.1)[28]和OsNPF2.4[21]。OsNPF7.9組織定位結果表明該基因在根系、葉片和根莖結合處都有表達(圖4)，這與已報道的OsNPF7.9和OsNPF2.4組織定位結果比較相似，這兩個基因也在根系和葉片中都有表達[21,22]。

OsNPF7.9超表達能提高水稻地上部生物量，雖然根系NO3－濃度降低，但是地上部NO3－濃度提高，而根系向地上部總氮和硝酸鹽的轉運都提高了(圖7)，推測可能因為根系向地上部轉運了更多的硝酸鹽導致根系硝酸鹽濃度降低。同時OsNPF7.9超表達提高了水稻地上部的總氮濃度和總氮積累，而地下部的這些指標都沒有變化。我們計算了地下部向地上部的氮素轉運，也發現OsNPF7.9超表達提高了水稻氮素從根系向地上部的轉運(圖8)。擬南芥AtNPF7.3基因只在根系靠近木質部的中柱鞘細胞表達，而且敲除該基因后木質部傷流液和地上部硝酸鹽含量都顯著下降，說明AtNPF7.3參與了根系木質部硝酸鹽的裝載[14]。而另外一個基因AtNPF7.2在擬南芥根系和地上部的所有木質部導管的薄壁細胞都有表達，而且敲除基因后木質部傷流液中硝酸鹽含量提高了[16]。在進化樹上OsNPF7.9與AtNPF7.3以及AtNPF7.2的親緣關系較近，推測OsNPF7.9具有類似的功能，能夠連接地下部和地上部硝酸鹽的運輸。

綜上所述，OsNPF7.9是位于細胞膜上的蛋白，可能參與硝酸鹽從根系向地上部的轉運，而且OsNPF7.9超表達可以提高氮素積累和轉運能力。

圖8 OsNPF7.9超表達水稻的總氮濃度、積累和轉運Fig. 8. Total N concentration, accumulation and transport of OsNPF7.9 overexpression rice.

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Function Analyses of Rice Nitrate Transporter Gene OsNPF7.9 in Nitrogen Accumulation and Transport

FENG Huimin*, LU Hong, WANG Hanqing, LI Xinyue
(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: huimin.feng@njau.edu.cn)

【Objective】 NPF family in plants can transport nitrate and peptide, etc. Functional analyses of OsNPF7.9 can lay a theoretical basis for studying molecular mechanism of high nitrogen use-efficiency.【Method】 Bioinformatics of OsNPF7.9 was predicted with different biological softwares. The OsNPF7.9 promoter-GUS transgenic rice was obtained for analyzing the spatial expression pattern of OsNPF7.9. And the expression patterns of OsNPF7.9 under different N supply levels were observed using semi-quantitative RT-PCR and pOsNPF7.9::GUS transgenic rice. OsNPF7.9 overexpressing rice was obtained, and their different physiological indexes were measured. 【Result】 OsNPF7.9 is localized on plasma membrane with 12 transmembrane domains and a big hydrophilic loop between the 6th and the 7th transmembrane domain. Tissue expression pattern showed that OsNPF7.9 was expressed in roots, leaves, root-shoot junction and flowers. Both RT-PCR and GUS staining of pOsNPF7.9::GUS transgenic rice indicated that the expression of OsNPF7.9 was not affected by N concentration and form. Overexpression of OsNPF7.9 could significantly increase not only nitrate concentration in shoots and roots-shoots nitrate ratio; but also total nitrogen concentration and accumulation in shoots, and roots-shoots total nitrogen ratio. 【Conclusion】OsNPF7.9 participated nitrate transport from roots to shoots, and overexpression of OsNPF7.9 could increase N accumulation and transport from roots to shoots.

rice; nitrogen; OsNPF7.9; nitrate transporter

Q786; S511.01

A

1001-7216(2017)05-0457-09

2017-03-15; 修改稿收到日期：2017-04-06。

國家自然科學基金資助項目(31401938)；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(Y0201500014，Y0201600366)。