水稻著絲粒特異組蛋白CENH3抗體的制備與應用

薛超 張融 郭瑞 劉帥 劉曉宇 沈明晨 鄧世峰 龔志云

(揚州大學 農學院/江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/江蘇省糧食作物現代產業技術協同創新中心/教育部植物功能基因組學重點實驗室，江蘇 揚州 225009；*通訊聯系人，E-mail: zygong@yzu.edu.cn)

水稻著絲粒特異組蛋白CENH3抗體的制備與應用

薛超 張融 郭瑞 劉帥 劉曉宇 沈明晨 鄧世峰 龔志云*

(揚州大學 農學院/江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/江蘇省糧食作物現代產業技術協同創新中心/教育部植物功能基因組學重點實驗室，江蘇 揚州 225009；*通訊聯系人，E-mail: zygong@yzu.edu.cn)

【目的】著絲粒是真核生物染色體的基本功能元件之一，其功能是在細胞有絲分裂和減數分裂時期精確地調控染色體配對和分離并維持染色體的穩定。著絲粒結構是由DNA和蛋白質形成的一種復合體。著絲粒特異組蛋白(centromere-specific histone H3, CENH3)是功能著絲粒是否具有活性的最基本特征。所以制備CENH3的相關抗體是進行著絲粒結構與功能研究的前提條件之一。【方法】通過設計短肽進行兔免疫實驗，制備了水稻著絲粒特異組蛋白CENH3兔源抗體，利用ELISA和蛋白免疫熒光(immunofluorescence, IF)等檢測方法對抗體有效性進行了鑒定?！窘Y果】ELISA檢測顯示制備的CENH3抗體有效稀釋度為1: 40萬，并且蛋白免疫熒光信號在水稻體細胞每條染色體的著絲粒區域均能檢測到。同時，該抗體也可以應用于玉米等其他物種。通過染色質免疫沉淀(ChIP)技術獲得與CENH3相結合的DNA分子，并進行PCR擴增和FISH定位分析，結果顯示相應的ChIP-DNA位于水稻功能著絲粒區域?！窘Y論】本研究制備的水稻CENH3兔源抗體能滿足著絲粒研究中相關實驗的要求，可進一步應用于著絲粒的結構與功能研究。

水稻；著絲粒特異組蛋白；染色質免疫沉淀；蛋白免疫熒光

著絲粒是真核生物染色體中重要的結構與功能元件, 是由DNA和蛋白質組成的復合體, 是真核生物有絲分裂和減數分裂過程中染色體正常分離和傳遞所必需的染色體區域[1]。每條染色體必須擁有正常的功能著絲粒, 以維持物種染色體組成的穩定性。目前, 已在擬南芥、水稻、玉米等植物的著絲粒進行了較深入的分子生物學研究,都表明了著絲粒的功能非常保守, 但真核生物各物種的著絲粒DNA序列卻是高度變異的[2-4]。著絲粒DNA序列進化速率極高, 在不同物種中, 組成著絲粒的DNA序列是沒有同源性的[5]。除芽殖酵母的著絲粒以外[6-7], 大多數生物的著絲粒均由高度重復的DNA序列構成, 并且在這些重復序列會間或插入一些逆轉座子成分, 一起組成著絲粒特異DNA序列[8-12]。

相比之下, 著絲粒區域另外一個重要組成成分——著絲粒特異蛋白在真核生物中則相對保守。其中, 著絲粒特異組蛋白H3(centromere-specific histone H3, CENH3)是較早發現的一種重要蛋白,存在于真核生物活性著絲粒的核小體中, 是著絲粒形成的早期標志[13-15]。第一個鑒定出的CENH3是人類活性著絲粒上的CENP-A蛋白[16]。CENH3是功能著絲粒染色質最基本的特征, 與CENH3相連著絲粒染色質只包含一小部分的衛星DNA[17]。比如, 在栽培稻第8染色體的著絲粒中,與CENH3結合的衛星DNA(CentO)約為750 kb,即其功能著絲粒的大小約為750 kb。CENH3在著絲粒染色質的識別和保持中起關鍵作用[4], 決定動粒組裝的位置和著絲粒的活性, 而且僅存在有活性的著絲粒中[18-23]。研究表明, 在果蠅和老鼠中, 當CENH3被破壞或者缺失時, 染色體不能正常傳遞[24-25]。在植物中，不同染色體著絲粒區域的DNA序列雖然差異很大，但是與CENH3結合的區域大小是一致的。如水稻中，通過CENH3的蛋白免疫熒光檢測，12條染色體著絲粒區域的CENH3信號強度是一致的[26]。此外，在擬南芥、玉米和甘蔗等植物中也鑒定出CENH3，幾乎存在于整個細胞周期中[15,27-28]。雖然著絲粒的功能很保守，但不同于H3的保守性，CENH3的快速進化導致不同物種之間具有一定的特異性。因此,對CENH3進行研究具有重要的意義。

真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在。因此, 研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互關系是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質免疫沉淀技術(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前研究體內DNA與蛋白質相互作用的主要方法之一, 其基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA復合物, 并將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然后通過免疫學方法沉淀此復合體, 特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段, 通過對目的片斷的純化與檢測, 從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息[29-33]。通過用CENH3抗體進行染色質免疫沉淀(ChIP)實驗, 可以確定所檢測的DNA序列是否屬于著絲粒的功能DNA元件, 同時對于CENH3抗體發生免疫沉淀的染色質進行克隆與分析, 可獲得功能著絲粒DNA序列[34]。ChIP實驗表明, 擬南芥、玉米、水稻和甘蔗等植物通過衛星DNA和反轉錄轉座子元件能與CENH3發生相互作用, 說明衛星DNA和反轉錄轉座子元件CR(centromere- specific retrotransposon)是這些物種著絲粒的功能組成成分[35]。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一, 同時也是單子葉植物的模式生物。近年來隨著水稻全基因組測序的完成, 對水稻各染色體組中不同染色體著絲粒的組成也進行了深入分析。 其中, 栽培稻的著絲粒由串聯重復序列組成。 重復單元為155 bp的CentO。目前, 定位分析水稻著絲粒的方法除了對CentO的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)分析外, 還可以利用CENH3抗體進行蛋白免疫分析。通過與水稻CENH3結合的蛋白免疫反應研究表明, 水稻每一著絲粒結合的CENH3是十分相近的, 說明不同染色體著絲粒功能DNA結合區域是特定的[26]。目前水稻CENH3抗體商品化產品很少，即使有也由于其特定的使用范圍，價格比較昂貴，所以相關研究中的大多數抗體由國外實驗室贈送，但一般情況下獲得的途徑比較麻煩，因此制備CENH3抗體對進一步開展水稻或其他物種著絲粒的相關研究具有重要意義。

本研究對水稻著絲粒特異組蛋白CENH3抗體進行制備, 并利用ELISA方法對抗體的效價進行測定, 通過蛋白免疫熒光進一步驗證該抗體的有效性。利用ChIP技術分析CENH3抗體, 對沉淀下來的DNA進行PCR和FISH分析, 以明確該抗體應用于水稻著絲粒研究的可能性, 并且對該抗體是否能應用于其他物種進行了鑒定，為進一步利用和推廣該抗體開展著絲粒相關研究奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括粳稻品種日本晴(Oryza sativa japonica, Nipponbare)、普通玉米(Zea mays)、小麥(Triticum aestivum)和大麥(Hordeum vulgare)種子。

1.2 水稻CENH3抗體的制備

本研究中通過人工設計合成CENH3的相關多肽, 對兔子進行7次免疫后, 取兔子全血進行純化。得到的抗體通過ELISA方法檢測效價?？贵w的效價為大于NC值2倍且大于0.25時的OD450值, 當效價大于2時, 我們認為抗體是呈陽性的。ELISA方法檢測具體步驟如下:

取純化的CENH3蛋白以濃度為1 μg/mL包被酶標板, 每孔200 μg, 蓋上蓋子放入37℃溫箱溫育2 h。然后取出包被和封閉好的酶標板, 將封閉液甩入水池, 用自來水沖洗2次, 在毛巾上拍干6次。選用HIS抗體(用牛奶稀釋, 1 mg/mL HIS抗體與牛奶的體積比為1∶8000)作為陽性對照, 陰性對照為5%牛奶,并進行稀釋(稀釋度分別為3125, 6250, 1.25萬, 2.5萬, 5萬, 10萬, 20萬, 40萬, 80萬), 每孔100 μg, 蓋上蓋子放入37℃溫箱溫育1 h后, 取出酶標板, 將板內的一抗甩入水池, 自來水沖洗8遍, 拍干。將稀釋好的二抗以每孔100 μg的量依次加入酶標板孔中, 蓋上蓋子放入37℃溫箱溫育45 min。從溫箱取出二抗溫育好的酶標板, 甩去二抗, 用自來水沖洗10次, 在吸水毛巾上拍干。將準備好的顯色液按每孔100 μg的量依次加入酶標板孔中, 蓋上蓋子放入溫箱，15 min后從溫箱取出酶標板, 將2 mol/L硫酸以每孔50 μg的量依次加入酶標板孔中終止反應, 讀取吸光值。

1.3 蛋白免疫熒光檢測

根尖染色體制備: 采集新鮮根尖, 用4%多聚甲醛(w/v)室溫固定30～40 min, 然后用1×磷酸鹽緩沖液(8.0 g NaCl, 0.2 g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO4, 0.2 g KCl, 雙蒸水定容至1 L，調pH至7.4)清洗3次, 并保存在1×磷酸鹽緩沖液中, 于4℃冰箱中保存備用。從磷酸鹽緩沖液中取出準備好的根尖材料, 取1 mm左右根尖于載玻片上, 加1滴磷酸鹽緩沖液, 加蓋玻片壓片, 壓好的載玻片迅速放于液氮中, 冷凍1～2 min, 用刀片迅速揭去蓋玻片, 晾干。

蛋白免疫熒光(immunofluorescence，IF)檢測:向染色體制備好的載玻片上滴加30 μL含有R(兔源)-CENH3抗體的1×TNB溶液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.5; 0.15 mol/L NaCl; 0.5%阻斷劑), 蓋上蓋玻片,放入濕盒內于37℃下保溫4 h以上; 取出后用1×磷酸緩沖液洗片3次, 每次5 min, 加50 μL含有anti-Rabbit-488抗體(Invitrogen)的1×TNB溶液, 放入濕盒內于37℃避光保溫1 h; 1×磷酸鹽緩沖液洗片3次, 每次5 min, 晾干后, 加10 μL含有DAPI的抗褪色劑(Vector Laboratories, Inc.), 蓋上蓋玻片, 在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 染色質免疫沉淀

1.4.1 細胞核的提取

染色體免疫共沉淀(ChIP)實驗參照Nagaki等的實驗方法[35]并有所優化。取8～10 d的日本晴幼苗葉片在液氮中研磨成粉狀, 加等體積的抽提緩沖液M1(4 mL 0.1 mol/L磷酸鉀, pH 7.0, 4 mL 1 mol/L NaCl, 31.25 μL β-巰基乙醇, 4.74 mL己二醇, 加ddH2O至40 mL)后放置在冰上, 于搖床上緩慢搖5 min。用滅菌后的Miracloth(EMD Chemicals, Inc.)過濾, 濾液在2410 r/min、4℃下離心10 min，去上清。加10 mL抽提緩沖液M2(3 mL 0.1 mol/L磷酸鉀, pH 7.0, 3 mL 1 mol/L NaCl, 300 μL 1 mol/L氯化鎂, 23.43 μL β-巰基乙醇, 3.54 mL己二醇, 130 μL Triton X-100, 加ddH2O至30 mL)混勻, 2410 r/min、4℃下離心10 min，去上清, 反復操作3次, 如沉淀中有雜質, 再重復上述操作。

1.4.2 細胞破碎

先加5 mL MNB緩沖液(2 mL 50%蔗糖, 0.5 mL 1 mol/L Tris-HCl, pH7.5, 40 μL 1 mol/L MgCl2, 10 μL 1 mol/L CaCl2, 加ddH2O至10 mL)對細胞核進行清洗, 于2410 r/min、4℃下離心10 min, 去上清。再加4 mL MNB緩沖液混勻, 分裝成3管,每管1200 μL, 剩下的作為input, 在分裝的3管中分別加1.5 U的MNase(Sigma)對DNA片段進行切割, 于37℃水浴鍋中水浴10 min, 每2 min搖1次。加15 μL EDTA終止反應。于13 000 r/min、4℃下離心10 min，取上清, 用瓊脂糖凝膠電泳檢測切割結果。切割后的DNA片段大小約147 kb。1.4.3 染色體免疫共沉淀

加入特異性抗體CENH3及溫育緩沖液[1 mL 1 mol/L NaCl, 400 μL 1 mol/L Tris-HCl, pH 7.5, 200 μL 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0, 40 μL 0.1 mol/L PMSF, 200 μL蛋白酶抑制劑混合物(Complete Mini), 加ddH2O至20 mL], 密封、8℃下，上下顛倒孵育過夜, 然后再用Protein A beads(GE Healthcare)密封放置在8℃上下顛倒孵育2 h。通過不同濃度的鹽溶液洗去與beads結合的非特異性染色質, 加400 μL 42℃預熱的洗提緩沖液(500 μL 1 mol/L NaCl, 200 μL 1 mol/L Tris-HCl, pH 7.5, 100 μL 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0, 500 μL 20% SDS, 加ddH2O補足至10 mL), 于65℃水浴鍋水浴15 min, 每5 min搖1次, 于13 000 r/min、室溫下離心5 min，取上清, 重復上次操作, 收集合并兩次上清, 然后收集并純化沉淀下來的ChIP-DNA。

1.4.4 ChIP-DNA的引物設計與PCR檢測

設計的引物序列: CentO上游引物5′-TGC GATGTTTTCTACTGGAATC-3′; CentO下游引物5′-AAATCATGTTTTGGCTCTTTTT-3′。

以ChIP-DNA作為模板, 使用20 μL體系(Sangon Biotech)進行PCR擴增, 反應體系為: 1 μL ChIP-DNA模板, 2 μL 10×緩沖液(含Mg2+), 1.6 μL dNTPs(2.5 mmol/L), 上下游引物各2.5 μL, 0.2 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL), 加超純水補足至20 μL。PCR擴增反應結束后取10 μL PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳, 凝膠成像系統觀察電泳結果, 并拍照保存。

1.5 熒光原位雜交檢測

1.5.1 根尖固定

取新鮮根尖置于2 mmol/L的8-羥基喹啉中,在20℃下處理2 h。用卡諾固定液(v甲醇∶v冰醋酸=3∶1)清洗3次后再用固定液室溫固定24 h, 然后置于－20℃下備用。從固定液中取出固定好的根尖,用蒸餾水清洗3次。切取2 mm左右的白色根尖部位置于酶解液(2%纖維素酶與1%果膠酶), 37℃下酶解40 min。酶解完全的根尖經固定液清洗2次后, 用固定液再次固定5 min以上, 可置于－20℃下冷卻待用。

1.5.2 染色體制備

將充分冰凍的根尖取出, 置于一張載玻片上,滴加適量固定液于根尖上。用鑷子迅速敲碎根尖,再在載玻片上滴加少量固定液, 在酒精燈上點燃,使其充分燃燒, 斜置玻片晾干待用。

1.5.3 探針標記

把1 μg ChIP-DNA溶于16 μL雙蒸水中。加入4 μL DIG-Nick-Translation Mix (Roche)混勻,離心。在15℃下反應90 min。停止反應后, 加入1 μL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)終止反應。標記的探針－20℃下保存備用。

1.5.4 FISH檢測

在制備好的載玻片上加入70%甲酰胺50 μL,蓋上蓋玻片。將玻片置于85℃的雜交爐中100 s。取出置于70%的冰酒精中, 脫色搖床5 min, 然后分別置于90%、100%酒精中脫色搖床各2 min, 取出晾干。配置雜交液(含ChIP-DNA探針)置于沸水中水浴5 min, 然后置于冰中5 min以上。每玻片滴加20 μL雜交液, 置于雜交盒中, 放入37℃恒溫箱過夜處理。取出后用1×磷酸緩沖液脫色搖床3次, 每次5 min。FISH信號通過抗地高辛抗體偶聯羅丹明偶聯物(anti-digoxigenin-Rhodamine)檢測, 染色體用DAPI反染。Olympus BX60鏡檢中獲得清晰圖像后, 以氣冷式數碼相機(CCD) (Olympus, DP80)攝像。

2 結果與分析

2.1 CENH3抗體的多肽合成與效價分析

根據NCBI的蛋白序列庫得到CENH3的序列如下:

N′-MARTKHPAVRKSKAEPKKKLQFERSP RPSKAQRAGGGTGTSATTRSAAGTSASGTPR QQTKQRKPHRFRPGTVALREIRKFQKTTELLIP FAPFSRLVREITDFYSKDVSRWTLEALLALQE AAEYHLVDIFEVSNLCAIHAKRVTIMQKDMQ LARRIGGRRPW-C′。

設計近氨基端的14個氨基酸序列(AEPKKK LQFERSPR)進行多肽人工合成, 合成成功后利用該多肽進行兔免疫實驗, 進行抗體制備。7次免疫后提取兔血清, 進行抗體效價的ELISA。由于HIS抗體分子量較小并且容易分離和純化, 選其作為系統操作的陽性對照, 效價（即OD450值）為2.758；陰性對照為5%牛奶, 效價為0.075。血清抗體稀釋度為3125, 6250, 1.25萬, 2.5萬, 5萬, 10萬, 20萬, 40萬, 80萬時, 效價分別為2.491, 2.671, 2.758, 2.665, 2.652, 2.685, 2.457, 2.034, 1.084?？梢姡斞蹇贵w稀釋度為1∶80萬時, OD450值小于2, 該濃度下的抗體呈陰性, 抗體靈敏度較低; 在稀釋度為1∶40萬以內的效價都大于2, 抗體靈敏性較好。因此制備的血清抗體其有效的稀釋度要控制在1∶40萬以內。

2.2 CENH3蛋白免疫熒光分析

蛋白免疫熒光分析是檢測著絲粒相關蛋白抗體是否有效的主要手段之一。通過觀察信號在染色體上的位置和強弱來判斷抗體的使用價值。

我們利用通過ELISA分析合格的CENH3抗體, 對水稻材料日本晴的根尖細胞進行蛋白免疫熒光檢測(圖1), 其中染色體用含DAPI抗褪色劑反染, 如紅色區域所示; 綠色信號為CENH3蛋白信號, 在細胞有絲分裂間期、前期、中期和后期時期信號都明顯可見。在有絲分裂間期看不出著絲粒區域所在位置, 但是染色質經堿性染料DAPI染色, 染色較深的區域是異染色質區域(圖1-A1中箭頭所示), 染色較淺的區域是常染色質區域, 而著絲粒就位于異染色質區域?？梢钥闯? CENH3信號都出現在異染色質區域(圖1-A3中箭頭所示); 在有絲分裂前期(圖1-B), 染色體形態分明, 可以清晰的辨識出染色體的主縊痕, 即著絲粒區域(圖1-B1中箭頭所示), 其中，共有24個CENH3的信號并且均位于染色體的著絲粒區域; 有絲分裂中期(圖1-C), 染色體并排分布在赤道板上, 在中期結束后染色體將加倍, 而CENH3的信號也將隨著著絲粒而加倍。細胞分裂后期(圖1-D), 染色體隨著著絲點被拉向兩級, CENH3信號均位于子細胞的一側(如圖1-D3所示)。在所觀察的有絲分裂的各個時期的細胞中, 均能觀察到明顯可見的CENH3的信號, 表明制備的抗體可用于蛋白免疫熒光分析。

圖1 水稻日本晴根尖細胞CENH3抗體的蛋白免疫熒光信號檢測分析Fig. 1. Immunofluorescence analysis of CENH3 antibody in somatic root tip cells of Nipponbare.

圖2 大麥(A)、小麥(B)和玉米(C)根尖細胞CENH3抗體的蛋白免疫熒光信號檢測分析Fig. 2. Immunofluorescence analysis of CENH3 antibody in somatic root tip cells of barley(A), wheat(B) and maize(C).

同時, 為了驗證制備的CENH3抗體是否在其他作物上也有效,分別對小麥、大麥和玉米的根尖染色體進行了蛋白免疫熒光檢測(圖2)。在小麥和大麥的根尖染色體上并沒有檢測到CENH3信號, 但是在玉米上能夠觀察到明顯的CENH3信號, 并且也位于著絲粒區域。說明本研究制備的CENH3抗體在玉米中的蛋白免疫熒光分析有效。

2.3 ChIP-DNA的PCR分析

由于水稻著絲粒是由蛋白和DNA組成的復合體, 所以分析與著絲粒蛋白相結合DNA序列的特征是進行著絲粒功能和結構分析的重要內容之一。近年來發展的染色質免疫共沉淀(ChIP)方法是研究蛋白與DNA互作的主要手段。為了進一步分析本研究中所獲得的著絲粒蛋白CENH3抗體是否能應用于相關的ChIP分析, 我們利用該抗體進行ChIP-PCR驗證該DNA是否來源于水稻著絲粒特異DNA序列。

通過分別對基因組DNA(Input), 陰性對照(Mock)和ChIP-DNA設置兩個重復組, 以水稻著絲粒特異DNA序列CentO設計引物對進行PCR擴增(圖3)。以陽性對照(基因組DNA)為模板擴增出相關條帶, 由于水稻著絲粒特異DNA序列CentO是重復序列, 所以擴增出3個條帶, 而陰性對照(Mock)幾乎沒有相應條帶擴增出。而由CENH3抗體所獲得的ChIP-DNA序列為模板可以擴增出相應條帶, 并與陽性對照相吻合。說明該ChIP-DNA來源于水稻著絲粒特異DNA序列。

2.4 ChIP-DNA的FISH定位分析

染色體熒光原位雜交(FISH)是驗證重復序列在染色體上具體位置的重要方法之一。為了進一步驗證CENH3抗體的ChIP-DNA是否位于著絲粒區域, 我們將ChIP-DNA標記成FISH探針, 進行熒光原位雜交。根據FISH的檢測結果(圖4), 紅色信號為染色體, 綠色信號為ChIP-DNA的雜交信號, 其中ChIP-DNA的信號位于染色體著絲粒區域, 進一步說明該ChIP-DNA位于水稻著絲粒區域, 是與著絲粒特異組蛋白CENH3特異結合的DNA序列。

圖3 CENH3抗體免疫沉淀DNA的PCR結果Fig. 3. PCR results of ChIP-DNA immunoprecipitated with CENH3 antibody.

3 討論

本研究中制備的CENH3抗體, 通過效價的測定和蛋白免疫熒光檢測, 都證明了CENH3抗體的有效性, 蛋白熒光信號存在于水稻細胞各時期的著絲粒上。同時, 對制備的CENH3抗體進行染色質免疫沉淀, 得到ChIP-DNA, 通過FISH定位分析進一步證明制備的CENH3抗體可用于ChIP分析。

圖4 日本晴根尖細胞ChIP-DNA的熒光原位雜交信號檢測結果Fig. 4. FISH analysis of ChIP-DNA in somatic root tip cells of Nipponbare.

CENH3是組蛋白H3的變體, 存在于真核生物的功能著絲粒中[18]。近年來, 在玉米、水稻和擬南芥中都鑒別出植物的CENH3。對于著絲粒特異組蛋白CENH3的定位分析重要的方法之一就是利用對應的抗體進行蛋白免疫熒光檢測。目前,可用于蛋白免疫熒光分析的抗體很多, 但是這些抗體不一定可以用到ChIP分析上, 這一方面和抗體的制備有關系, 另一方面是由于抗體的復雜性導致非特異性反應較多, 從而導致實驗結果無法判斷, 所以對于制備的抗體需要進一步的純化。此前, 我們實驗室使用的CENH3抗體都是購買或贈與的國外制備抗體, 獲得途徑繁瑣或研究成本較高, 所以很有必要通過自己制備有效可用的CENH3抗體。本研究中, 我們制備的水稻CENH3抗體, 先后通過ELISA方法測定效價, 蛋白免疫熒光進行檢測, 都證實制備的CENH3抗體是有效的。同時, 進一步的ChIP分析和FISH定位分析證明由該抗體所免疫共沉淀獲得的DNA序列是屬于水稻功能著絲粒區域。確定制備的CENH3抗體具有較好的特異性, 可應用于與著絲粒結構與功能分析的相關實驗中, 對進一步解析水稻CENH3及著絲粒功能關系的研究提供了便利條件。另外，該抗體還可以應用于玉米等其他物種，

為進一步推廣該抗體的使用提供可能。

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Preparation and Application of Centromere-Specific Protein CENH3 Antibody in Rice

XUE Chao, ZHANG Rong, GUO Rui, LIU Shuai, LIU Xiaoyu, SHEN Mingchen, DENG Shifeng, GONG Zhiyun*
(Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;*Corresponding author, E-mail: zygong@yzu.edu.cn)

【Objective】 The centromeres of eukaryotic chromosomes are essential for cell division and inheritance of genetic information. The centromere is a complex composed of centromeric proteins and DNA motifs. In particular, a centromere-specific histone 3 variant, referred to CENH3, is a key centromere-specific protein for centromeric chromatin. So the preparation of CENH3 antibody is necessary for the research of centromeric structure and function.【Method】We designed a short-peptide for the rabbit immune experiment and prepared CENH3 antibody in rice. ELISA and protein immunofluorescence(IF) assay were performed to detect the effectiveness and availability of CENH3 antibody. 【Result】 The effective dilution of CENH3 antibody was detected at 1:400 000. Through IF analysis, obvious signals were detected in the centromeric region of each chromosome in rice and maize. DNA associated with CENH3 was selectively immunoprecipitated in chromatin immunoprecipitation assay(ChIP). After PCR amplification and FISH(fluorescence in situ hybridization) analysis, the results showed ChIP-DNA was located in functional centromere in rice. 【Conclusion】 These results demonstrated that CENH3 antibody prepared in this study can meet the requirement of related experiments in the research of centromere, and the antibody was prepared successfully.

rice; centromere-specific histone; chromatin immune-precipitation assay; immunofluorescence

Q786; S511.01

A

1001-7216(2017)05-0475-08

2017-03-24; 修改稿收到日期：2017-05-18。

國家自然科學基金面上項目(3137021)；江蘇省“青藍工程”項目。