慶大霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究

嚴(yán)寶冬

黑龍江格林赫思生物科技有限公司 大慶 166400

慶大霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究

嚴(yán)寶冬

黑龍江格林赫思生物科技有限公司 大慶 166400

目的：對慶大霉素發(fā)酵的培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，通過對幾種主要原輔料玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質(zhì)碳酸鈣的用量進行調(diào)整，最后確定的培養(yǎng)基組合大大提高了發(fā)酵生產(chǎn)水平，而且降低了生產(chǎn)成本。

慶大霉素；培養(yǎng)基；發(fā)酵；優(yōu)化

慶大霉素是一類由微生物或其他生命過程中合成的次級代謝產(chǎn)物或其人工衍生物，它們在很低濃度時就能抑制或干擾它種生物（包括病原菌，病毒，癌細胞等）的生命活動，因而可用作優(yōu)良的化學(xué)治療劑，也是臨床上廣泛使用的處方藥。慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，主要是由絳紅小單孢菌（Micromonospora purpurea）、棘孢小單孢菌（M.echinospora）發(fā)酵產(chǎn)生的一種殺菌力較強的多組分氨基糖胺類廣譜抗生素。1963年由美國先令公司W(wǎng)einstein等發(fā)現(xiàn)，1969男被用于臨床，國外稱之艮他霉素或正泰霉素。慶大霉素同時也是我國獨立自主研制成功的廣譜抗生素。1966年，我國著名的微生物學(xué)家王岳和助手從小單孢菌中分離到全國聞名的慶大霉素產(chǎn)生菌，并且在 1967年開始研制，到1969年底獲得成功。之所以取名“慶大霉素”，是為了慶?！熬糯蟆币约肮と穗A級的偉大勝利。目前，慶大霉素仍然是臨床上和畜牧業(yè)治療各種革蘭氏陰性菌感染的主要抗生素之一。因此，慶大霉素的相關(guān)研究仍然具有重要意義。

我國慶大霉素的生產(chǎn)歷史已經(jīng)有四十余年，國內(nèi)生產(chǎn)慶大霉素的生產(chǎn)廠家主要為福抗、煙臺只楚藥業(yè)、南陽普康集團、上海先鋒，總體來說生產(chǎn)水平不高，生產(chǎn)工藝改進也不大，生產(chǎn)菌種大多選擇絳紅小單孢菌，一般采用深層液態(tài)發(fā)酵法，國內(nèi)生產(chǎn)水平一般維持在1200-1400U/ml左右，產(chǎn)量較低。國外生產(chǎn)菌株多使用棘孢小單孢菌或橄欖星小單孢菌，發(fā)酵周期較長、成本較高，這也使得生產(chǎn)受到一定的限制。

目前對于慶大霉素提高單位效價的措施主要是優(yōu)良菌種的篩選和工藝的優(yōu)化兩種方式。大多數(shù)工廠對慶大霉素提高發(fā)酵單位的措施主要是工藝優(yōu)化。雖然國內(nèi)外眾多科研工作者曾經(jīng)致力于采用傳統(tǒng)的誘變育種手段來改造小單孢菌的生物合成，但是往往收效甚微。

慶大霉素生產(chǎn)的培養(yǎng)基主要為玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質(zhì)碳酸鈣，本文主要針對這幾種培養(yǎng)基的最佳用量進行正交化組合，得到最佳的培養(yǎng)基用量組合，從而提高慶大霉素的發(fā)酵生產(chǎn)水平。

1.資料和方法

1.1 菌種：絳紅小單孢菌（黑龍江格林赫思生物科技有限公司生產(chǎn)用菌種）。

1.2 培養(yǎng)基

玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質(zhì)碳酸鈣、硫酸銨、硝酸鉀等。

1.3 設(shè)備

1.3.1 實驗室設(shè)備：搖瓶機，500ml三角瓶

1.3.2 發(fā)酵罐：1500L發(fā)酵罐

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 搖瓶發(fā)酵

將子瓶斜面菌種在無菌室內(nèi)挑取2cm2接種于滅菌后的搖瓶培養(yǎng)基中，每瓶500ml三角瓶裝量50ml培養(yǎng)基，37±1℃、360r/min培養(yǎng)135小時，放瓶取樣，檢測慶大霉素生物效價及其組分比例。

1.4.2 1500L發(fā)酵罐發(fā)酵

將5瓶子瓶斜面菌種在無菌室用無菌水洗下，制成孢子懸浮液，將孢子懸浮液接入1500L發(fā)酵罐，罐壓0.05Mpa，通氣量1:1，攪拌速度120r/min，，發(fā)酵培養(yǎng)135小時 ，放罐，測定慶大霉素生物效價及其組分比例。

1.5 效價測定

采用抗生素微生物檢定法。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶發(fā)酵結(jié)果

2.1.1 正交法設(shè)計實驗

發(fā)酵試驗的影響因素很多，培養(yǎng)基中主要是碳源氮源，為菌體生長提供了大部分能量，所以選擇培養(yǎng)基中5個主要因素進行研究：玉米淀粉、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨、輕質(zhì)碳酸鈣，根據(jù)單因子實驗結(jié)果確定各因素的最佳含量范圍，采取五因素三水平正交試驗?zāi)Ｊ?，因素水平表見?。

表1 正交試驗水平表

按照四水平五因素的實驗安排，共做 16組實驗，每一組實驗平行5瓶，所得結(jié)果為5瓶的平均結(jié)果，實驗結(jié)果見表2。

表2 L9（35）正交試驗結(jié)果

從表2中極差可以看出，以上5個因素對慶大霉素產(chǎn)量影響的順序為：玉米淀粉＞蛋白胨＞黃豆餅粉＞玉米粉＞輕質(zhì)碳酸鈣，實驗組中最佳結(jié)果是第八組，（A2B4C3D2E1），從分析數(shù)據(jù)中得出，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為A2B4C3D2E1，通過驗證試驗得出，這個配方的慶大霉素效價最終保持在1450u/ml左右，產(chǎn)量穩(wěn)定。根據(jù)原始配方，平行做出現(xiàn)用的培養(yǎng)基發(fā)酵試驗，最終效價穩(wěn)定在1200u/ml左右，新的最優(yōu)配方效價提高了16.7%。

所以確定最終培養(yǎng)基配方為玉米淀粉5.5g/L，玉米粉1.6g/L，黃豆餅粉4.0g/L，蛋白胨0.65g/L，輕質(zhì)碳酸鈣0.6g/L。

2.2 1500L噸發(fā)酵罐驗證結(jié)果

將優(yōu)化的培養(yǎng)基配方在1.5噸發(fā)酵罐上進行驗證，連續(xù)上罐7次，其結(jié)果見表3

從表3可以看出，慶大霉素的發(fā)酵過程中，應(yīng)用新的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，連續(xù)實驗效果很穩(wěn)定，并且經(jīng)過成本核算，生產(chǎn)成本較原有的培養(yǎng)基配方成本低，增加了生產(chǎn)利潤，降低了單位能耗。

3 結(jié)語

本實驗所采用的優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵所得結(jié)果，各組分比例滿足新藥典要求，并且雜志顯著降低，為下游的色譜分離工作帶來很大便利。

[1]郭家瑞，王衛(wèi)國，李磊，等.慶大霉素研究概述[J].海峽藥學(xué)，2009（10）.

[2]劉峰，楊桂英.改變慶大霉素發(fā)酵工藝對其組分及效價的影響[J].福建師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，（3）.

[3]李明奇.慶大霉素F99-3菌種發(fā)酵培養(yǎng)基和控制條件的研究[J].河南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，（3）.

[4]馮愛梅.慶大霉素生產(chǎn)工藝分析[J].安陽師范學(xué)院學(xué)報，2002，（5）.

[5]牛文澤，胡輝，儲炬，等.棘孢小單孢菌絳紅變種細胞壁肽聚糖對慶大霉素吸附機制的初步研究[J].中國抗生素雜志，2003，（2）.

[6]戴崗梅，譚振榮，汪又村，等.90～95年國內(nèi)慶大霉素生產(chǎn)動態(tài)及其進展分析[J].山東醫(yī)藥工業(yè)，1997，（1）

R 473.5

A

1672-5018（2017）03-028-01