IL-17A與IRF-5遺傳多態(tài)性與泉州地區(qū)類風濕關節(jié)炎相關性研究

羅彩林，鄭晨娜，，饒華春，楊會勇

1.泉州醫(yī)學高等專科學校基礎醫(yī)學部，福建泉州 362000；2.華僑大學分子藥物研究所，福建泉州 362000；3.泉州市正骨醫(yī)院臨床檢驗科，福建泉州 362000

IL-17A與IRF-5遺傳多態(tài)性與泉州地區(qū)類風濕關節(jié)炎相關性研究

羅彩林1，鄭晨娜1，2，饒華春3，楊會勇2

1.泉州醫(yī)學高等專科學校基礎醫(yī)學部，福建泉州 362000；2.華僑大學分子藥物研究所，福建泉州 362000；3.泉州市正骨醫(yī)院臨床檢驗科，福建泉州 362000

目的 該文探討白介素-17A（IL-17A）rs8193036C/T、rs2275913A/G與干擾素調節(jié)因子5（IRF-5）rs729302A/C基因多態(tài)性與福建泉州地區(qū)人群類風濕關節(jié)炎(RA)的易感性關聯(lián)。 方法 采用病例-對照研究法，自2014年3月—2016年4月收集泉州正骨醫(yī)院確診RA患者108例 （病例組）和149名健康對照者 （對照組），應用三引物全血擴增法 （AS-PCR）對IL-17A rs8193036,rs2275913和IRF-5 rs729302進行基因分型，并用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)結果分析。 結果RA組RF-陽性率、CRP-陽性率、ACCPA-陽性率分別為：88.89%、28.70%、72.22%，DAS28為（4.86±1.63）。IL-17A rs8193036C/T位點的3個基因型CC、TT、CT在健康對照組的分布頻率分別為57.0%、16.8%、26.2%，在RA組的分布頻率分別為61.1%、6.5%、32.4%，RA組的基因型頻率與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.042）,其中攜帶TT純合子基因型的RA患病風險較高。IL-17A rs2275913 G/A位點的3個基因型AA、GA、GG在健康對照組的分布頻率分別為23.5%、46.3%、30.2%，在RA組的分布頻率分別為13.0%、52.8%、34.3%，RA組基因型頻率與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義 （P=0.106）。IRF-5 rs729302A/C的AA、AC、CC基因型在健康對照組的分布頻率分別為50.3%、39.6%、10.1%，在RA組的分布頻率分別為47.7%、43.1%、8.3%,兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.781)。結論 IL-17A rs8193036C/T可能與泉州地區(qū)人群RA發(fā)病有弱相關性，其中IL-17A rs8193036中TT基因型攜帶者可能增加RA疾病的易感性。而IL-17A rs2275913A/G和IRF-5 rs729302A/C與泉州地區(qū)人群RA發(fā)病無相關性。

關節(jié)炎；類風濕；多態(tài)性；單核苷酸；白介素-17A；干擾素調節(jié)因子-5

遺傳因素如單核苷多態(tài)性可能在類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)的發(fā)病機制中起到重要的作用。白介素-17（Interleukin-17，IL-17）是由Th17細胞分泌的一種致炎癥因子，IL-17A/F基因多態(tài)性與許多自身免疫性疾病以及炎癥反應有相關性。干擾素調節(jié)因子-5（Interferon Regulatory Factor 5，IRF-5）在細胞多種生理活動中發(fā)揮作用，也在RA發(fā)病過程中起著重要的作用[1-2]。根據(jù)兩個基因在類風濕關節(jié)炎中的作用，該研究自2014年3月—2016年4月選取泉州市正骨醫(yī)院已確診的類風濕關節(jié)炎患者108例和在體檢過程中健康志愿者149名作為研究對象，探討了IL-17A rs8193036C/T、rs2275913A/G和IRF-5 rs729302A/C基因多態(tài)性與福建泉州地區(qū)人群類風濕關節(jié)炎(RA)的易感性關聯(lián)，為進一步探討泉州地區(qū)人群RA的發(fā)病特征與機制提供理論支持和數(shù)據(jù)分析。

1 對象與方法

1.1 對象

采用病例-對照法，所選的對象中類風濕關節(jié)炎患者達到ACR2010 RA分類標準，需要排除所選對象患有其他結締組織疾病，感染性或者惡性腫瘤等疾病，平均年齡（56±12.29）歲；健康志愿者排除糖尿病、腫瘤、心血管疾病等基礎性疾病，平均年齡在（55±11.69）歲。該研究由泉州市正骨醫(yī)院倫理委員會批準，實驗對象知情并同意研究的開展。

1.2 方法

1.2.1 外周血抽取 抽取待測人員的外周血，血液樣本用EDTA、肝素和枸櫞酸鈉等抗凝劑做抗凝處理，抽取的血樣于-20℃冰箱保存。

1.2.2 引物設計 從 ncbi網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲取該SNP位點附近序列，利用Primer 5.0設計一條公共引物和一對3′端分別與SNP位點互補等位基因特異性引物，其中3′端第3個堿基引入一個人為錯配堿基。IL-17A基因rs8193036C/T的一條通用引物序列FW 5’-CAGGAC AGGGAGGAATGGAT-3’，兩條特異性引物分別是RN1 5’-TAGAGACTGGACAAAGGTGACGG-3’；RN2 5’-TAGAGACTGGACAAAGGTGACGA-3’。SNP位點rs2275913A/G通用引物RW 5’-TGGATGAGTTTGTGCCTGCT-3’兩條特異性引物分別為FN1 5’-CTTCCCATTTTCCTTCAGACGA-3’；FN2 5’-CTTCCCATTTTCCTTCAGACGG-3’

IRF-5基因rs729302A/C通用引物Fw 5’-GGGCGGCATCGGGAGTGGAG-3’，兩條特異性引物分別為RN1 5’-GACTCTGGTGTGTAGGTGATCGTGT-3’；RN25’-GACTCTGGTGTGTAGGTGATCGTGG-3’。所有引物合成均來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.3 全血三引物擴增法（AS-PCR）采用該課題組建立的三引物全血等位基因特異性PCR擴增法（AS-PCR）進行目的基因的SNP分型檢測[3]。擴增體系如下：20 μL的體系加入0.3 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶（TaKaRa,大連），2 μL 2.5 mM dNTP，10 μmol/L通用引物和特異性引物各0.8 μL，2 μL 10×聚合酶鏈反應（PCR）緩沖液(含有Mg2+)，4 μL 50%甘油以及4 μL 5דYW”緩沖液 （該實驗室研發(fā)），最后無菌H20補足19.6 μL,震蕩混勻離心后加入外周血模板0.6 μL。反應體系參數(shù)設定：預變性溫度96℃，時間4 min；變性溫度95℃，時間30 s，復性溫度58℃，時間30 s，延伸溫度72℃，時間30 s，循環(huán)次數(shù)40；72℃延伸10 min，于4℃條件保存。擴增結束，吸取5 μL擴增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠，100 V電壓條件下電泳15 min。采用ExRed核酸染料進行染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶的位置和數(shù)目，并分析基因型。

1.3 統(tǒng)計方法

分析所選擇樣本目的基因各SNP基因型與類風濕關節(jié)炎發(fā)病風險，采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件統(tǒng)計分析；采用網(wǎng)絡工具進行Hardy-Weinberg檢驗遺傳平衡 (http://ihg.gsf.de/ihg/snps.html)，健康志愿者和類風濕關節(jié)炎患者組間比較采用χ2檢驗和logistic模型分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象特征分析及SNP位點Hardy-weinberg平衡檢驗

該文采用病例-對照研究法，其中RA患者年齡范圍從10～89歲，健康對照者年齡范圍從8～78歲，其中RA患者的臨床表現(xiàn)見表1。為了檢驗該研究人群是否符合隨機性抽樣原則，將RA患者組和正常對照組3個SNPs位點的分布頻率在 http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl網(wǎng)站進行 Hardy-weinberg平衡檢驗。結果表明除了 IL-17A rs8193036位點的健康對照組的群體基因遺傳平衡 （P＜0.05）之外，IL-17A rs8193036 RA患者組以及 IL-17A rs2275913A/G和IRF-5 rs729302A/C健康對照組和RA患者組群體基因遺傳平衡（P＞0.05），課件研究對象的選擇符合隨機性原則，研究對象具有群體代表性。

2.2 病例-對照組3個等位基因和基因型頻率分布比較

IL-17A rs8193036 C/T、IL-17A rs2275913 G/A和IRF-5 rs729302A/C在正常對照組和RA組基因型及等位基因分布頻率情況見表2。IL-17A rs8193036位點。

CC基因型在健康對照組的分布頻率為57.0%，在RA組為 61.1%，TT基因型在健康對照組的分布頻率為16.8%，在RA組為6.5%，CT基因型在健康對照組的分布頻率為26.2%，在RA組為32.4%，RA組的基因型頻率與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.042）,與攜帶CC或CT基因型的研究對象相比，攜帶TT純合子基因型的RA患病風險要高（TT vs.CC：OR,2.773；95%CI,1.130～6.805；P=0.022；TT vs.CC+CT:OR,2.909；95%CI,1.209～7.002；P=0.014）。健康對照組的等位基因C分布頻率為70.1%，RA組為77.3%；健康對照組的等位基因T分布頻率為29.9%，RA組為22.7%。等位基因C型和T型在RA-健康對照組患病風險比較，其OR值是1.451，95%CI為[0.969～2.173]，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.070＞0.05）。

表1 RA患者臨床特征

IL-17A rs2275913 G/A位點AA基因型在健康對照組的分布頻率為23.5%，在RA組為13.0%，GA基因型在健康對照組的分布頻率為46.3%，在RA組為52.8%，GG基因型在健康對照組的分布頻率為30.2%，在RA組為34.3%，該位點RA組的基因型頻率與健康對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.106）,與攜帶GG+GA基因型的患病風險相比較，攜帶AA基因型的患病風險要高 （AA vs. GA：OR,2.065；95%CI,1.013～4.210；P=0.044；AA vs.GG+ GA:OR,2.061；95%CI,1.049～4.058；P=0.034）。健康對照組的等位基因A分布頻率為46.6%，RA組為39.4%；健康對照組的等位基因G分布頻率為53.4%，RA組為60.6%。等位基因A型和G型在RA-健康對照組患病風險比較，其OR值是1.347，95%CI為[0.944～1.922]，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.099 8＞0.05）。

IRF-5 rs729302A/C的AA基因型在健康對照組的分布頻率為50.3%，在RA組為47.7%，AC基因型在健康對照組的分布頻率為39.6%，在RA組為43.1%，CC基因型在健康對照組的分布頻率為10.1%，在RA組為8.3%，該位點兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.781)。健康對照組的等位基因A分布頻率為70.1%，RA組為69.9%；健康對照組的等位基因C分布頻率為29.9%，RA組為30.1%。等位基因A型和C型與RA-健康對照組患病風險比較，其OR值是1.011，95%CI為[0.690～1.481]，亦差異無統(tǒng)計學意義(P=0.956，P＞0.05)。說明該位點與泉州地區(qū)人群RA易感性無相關性。

表2 病例-對照組三個等位基因和基因型頻率分布比較

3 討論

類風濕關節(jié)炎是一種慢性、自身免疫性疾病，屬于系統(tǒng)性炎癥。在RA發(fā)病發(fā)展的炎癥性細胞網(wǎng)絡中，Th17細胞在促進自身免疫性進程、骨損傷以及血管生成均起了重要作用。根據(jù)文獻資料選取 IL-17A rs2275913 G/A, rs8193036 C/T與泉州地區(qū)RA患者的相關性進行研究。Nordang等[4]檢測了IL-17A基因多態(tài)性與來自于挪威和新西蘭的高加索RA易感性的相關性研究，發(fā)現(xiàn)IL-17A rs2275913在挪威RA人群呈弱相關性，然而與新西蘭RA人群無關聯(lián)性。來自日本的研究報道IL-17A基因SNP rs3804513與2年內RA影像進程有弱相關性 （P=0.049），這說明IL-17在日本人群RA發(fā)病初期與骨關節(jié)損傷有一定的關聯(lián)[5]。Bogunia-Kubik等[6]和Pawlik等[7]兩個不同的研究團隊先后在波蘭RA人群研究中發(fā)現(xiàn)IL-17A基因rs2275913與 RA易感性無關聯(lián)性，而對 IL-17F基因rs763780與RA人群關聯(lián)性得出了完全相反的結論。選取了108例RA患者和149名健康對照者作為研究對象，其中發(fā)現(xiàn)rs8193036C/T位點等位基因頻率患者-健康對照者比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.042），與RA易感性有弱關聯(lián)性，其中攜帶TT純合子基因型的RA患病風險要高（TT vs.CC：OR,2.773；95%CI,1.130～6.805；P=0.022；TT vs.CC+CT:OR,2.909；95%CI,1.209～7.002；P=0.014）。Shen等人[8]研究發(fā)現(xiàn)IL-17A rs2275913和rs3819024兩個位點的等位基因可能會降低RA風險性。而該研究則發(fā)現(xiàn)攜帶IL-17A rs2275913 AA基因型的人群RA患病風險增高（AA vs.GA：OR,2.065；95%CI,1.013-4.210；P=0.044；AA vs.GG+GA:OR,2.061；95%CI,1.047-4.058；P=0.034），而該位點的基因型和等位基因頻率與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,這可能是該次選取的樣本數(shù)較少緣故或是存在地域性的差異所致。

IRF-5基因位于染色體7q32上，IRF-5的啟動區(qū)和5’UTR區(qū)的遺傳多態(tài)性與RA的易感有強相關性，因此該區(qū)域可用來分析IRF-5的轉錄機制以及與RA的發(fā)病機理之間的關系[9]。IRF-5同時還是一種轉錄因子，當機體受到病毒感染時，IRF-5激活并轉錄出IRF-5蛋白，再調控產(chǎn)生干擾素和其他致炎因子[10]，由此可見IRF-5在致炎細胞因子和趨化因子的轉錄調節(jié)中起重要作用。IRF-5的SNP位點在不同人群RA患者的相關性也不盡相同，如rs2004640，rs752637，rs3807306和rs3757385，在無CCP抗體人群中，保護性基因型分別為AGAC。而IRF-5rs2004640，rs729302和rs752637多態(tài)性與RA易感性在不同的族群相關性不同，該結果已在歐洲人和亞洲人群中得到證實，而其他族群這種關聯(lián)性需要進一步研究。從以上研究結果可以看出，IRF-5多態(tài)性與RA相關性依據(jù)人種群不同而不同，甚至在同一種群結構也有差異。該次選取了IRF-5基因rs729302位點作為研究對象，與福建泉州RA人群的相關性。實驗結果表明rs729302A/C在健康和RA患者比較，基因型和等位基因均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明該位點與福建泉州人群的RA易感性無相關性。

綜上所述，通過統(tǒng)計學分析得到IL-17A rs8193036C/ T,IL-17A rs2275913G/A和IRF-5 rs729302A/C基因多態(tài)性對福建泉州地區(qū)RA人群的易感性有一定的關聯(lián)，其中攜帶IL-17A rs8193036的TT基因和rs2275913的AA基因的人群可能屬于風險性較高的人群，而IRF-5 rs729302與該地區(qū)的RA人群無關聯(lián)性。

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Research on Correlation between the IL-17A and IRF-5 Genetic Polymorphism and Rheumatoid Arthritis in Quanzhou Region

LUO Cai-lin1,ZHENG Chen-na1,2,RAO Hua-chun3,YANG Hui-yong2
1.Basic Medicine Department,Quanzhou Medical College,Quanzhou,Fujian Province,362000 China；2.Institute of Molecular Medicine,Huaqiao University,Quanzhou,Fujian Province,362000 China；3.Department of Clinical Laboratory,Quanzhou Orthopedic-traumatological Hospital,Quanzhou,Fujian Province,362000 China

Arthritis;Rheumatoid;Polymorphism;Mononucleotide;Interleukin-17A;Interferon regulatory factor-5

R446

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.03.04

2017-06-07；

2017-06-27

福建省自然科學基金資助項目（2015J01138）;福建省自然科學基金資助項目（2016J01420）。

羅彩林（1981-），女，福建三明人，碩士，講師，研究方向：生物化學與分子生物學。

鄭晨娜（1978-），女，河北滄州人，碩士，副教授，研究方向：醫(yī)學診斷學、生物化學與分子生物學，E-mail:chennzh2009@126. com。

AbstractObjective To study the correlation between the interleukin-17A（IL-17A）rs8193036C/T,rs2275913A/G,（IRF-5）rs729302A/ C genetic polymorphism and susceptibility of rheumatoid arthritis in Quanzhou region.Methods 108 cases of RA patients and 149 cases of healthy people in our hospital from March 2014 to April 2016 were selected and respectively used as the case group and control group,and AS-PCR was used for genotyping of IL-17A rs8193036,rs2275913 and IRF-5 rs729302,and the data results were analyzed by the statistical software SPSS 18.0.Results The positive rates of RF,CRP and ACCPA in the RA group were respectively 88.89%,28.70%,72.22%and DAS28 was 4.86±1.63,and the distribution frequencies of three gene types of CC,TT,CT in the IL-17A rs8193036C/T sites in the healthy control group were respectively 57.0%,16.8%,26.2%,and the distribution frequencies in teh RA group were respectivly 61.1%,6.5%,32.4%,and the difference in the gene frequency between the RA group and healthy control group was statistically significnat（P=0.042）,and the prevalence risk of RA with TT homozygote genotype was higher and teh distribution frequencies of the three genetypes AA,GA,GG in the IL-17A rs2275913 G/A sites in the healthy control group were respectively 23.5%,46.3%,30.2%,and the distribution frequencies in the RA group were respectively 13.0%,52.8%,34.3%,and the differences between the two groups were not statistically significant（P=0.106）,and the distribution frequencies of AA,AC,CC of IRF-5 rs729302A/C in the healthy control group were respectively 50.3%,39.6%,10.1%and in the RA group were respectively 47.7%,43.1%,8.3%,and the differences between the two groups were not statistically significant(P=0.781).Conclusion IL-17A rs8193036C/T may have a weak correlation with the RA incidence in population in Quanzhou region,and TT genotype carriers of IL-17A rs8193036 may increase the susceptibility of RA disease,and IL-17A rs2275913A/G and IRF-5 rs729302A/C have no correlation with the RA incidence in population in Quanzhou region.