1株海綿共生真菌代謝產物的研究

龍海林　李康強　　許文東　　傅玉萍

[摘要] 綜合運用各種色譜分離技術對海綿共生真菌Emericella variecolor的固體大米培養基發酵產物進行化學成分研究，利用各種波譜技術進行化學結構鑒定。結果從該真菌的發酵產物中分離得到6個單體化合物，分別鑒定為 （+）2acetyldihydroterrein （1），（+）3acetyldihydroterrein（2），anditomin（3），andilesin A（4），andilesin C（5），andilesin B（6）。其中化合物1和2為新化合物。

[關鍵詞] 海綿共生真菌； Emericella variecolor； 化學成分

Study on metabolites from a spongederived fungus

LONG Hailin， LI Kangqiang， XU Wendong， FU Yuping*

（National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of Traditional Chinese Medicine，

Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangzhou 510240， China）

[Abstract] We have carried out the investigation on a spongederived fungus，which was identified as Emericella variecolor from the south sea of China. Two new chemical constituents，（+）2acetyldihydroterrein （1） and （+）3acetyldihydroterrein （2），with four known compounds，anditomin （3），andilesin A （4），andilesin C （5） and andilesin B （6），were isolated from this fungus by column chromatography over silica gel， Sephadex LH20， and ODS. The structures of 1 and 2 were elucidated by spectroscopic methods including NMR，HRESIMS，and CD.

[Key words] spongederived fungus； Emericella variecolor； chemical constituents

海洋真菌兼具種屬多樣、分布廣、代謝途經復雜的特性。據統計，已知約71.2萬種海洋真菌可棲身諸如水體、底泥、砂石等無機質生境，也可共附生于如藻類、無脊椎動物、魚類等活體[1]。海綿共生真菌所處的生態環境兼具陸地生態系統無法比擬的高壓、高鹽、低光照和寡營養的物理脅迫，也存在與其宿主長期協同進化過程中生物選擇脅迫，這種脅迫使兩者之間發生很多次基因重組或改變[2]，其互擾性和易擾性直接影響它們的次生代謝[34]。迄今為止，國內外學者已從海洋動植物共生真菌中發現一些活性分子，有些具有罕見的結構，如從海綿共附生真菌Penicillium terrestre中發現的膽堿酯酶抑制劑sorbiterrin A[5]，以及從海綿共附生細菌Ruegeria sp.中發現的新穎抗菌環肽類成分[6]等。國內外學者早在二十世紀六七十年代就已經開始對真菌Emericella variecolor進行化學成分研究，發現了多種類型的化合物，如酮類[7]、萜類[89]、多烯吡喃酮類[10]、苯甲醇類[11]等。為了獲得更多的活性化合物，本實驗采用大米固體培養基進行微生物發酵，在正常室溫條件下培養海綿共生真菌Emericella variecolor 30 d，再用乙酸乙酯萃取大米培養基，之后對提取物進行化學成分分離。在提取物中分離得到6個單體化合物，其中化合物1和2為新化合物，其他4個為已知化合物（圖1）。

1 材料

UV譜用JASCO V550 紫外可見分光光度儀測定；旋光值用Autopol Ⅲ automatic polarimeter型旋光儀測定；HRESIMS用Agilent 1100 series LC/MSD Trap SL型質譜儀測定；NMR用Bruker AvanceⅢ 400 MHz核磁共振儀測定；分析型HPLC用Shimadzu LC20AD 液相色譜儀測定，檢測器為SPDM20A；半制備使用Alltech LabAlliance Series Ⅲ儀器，配備UV檢測器。

硅膠薄層分析使用青島海洋化工廠的GF254薄層預制板；柱色譜硅膠（200～300目）為青島海洋化工廠產品；常壓反相ODS柱色譜使用的C18填料為日本YMC公司產品；凝膠柱色譜Sephadex LH20使用的是Pharmacia公司產品；分析用HPLC色譜柱為Thermo Scientific BDS Hypersil的C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；半制備柱為Waters SunfireTM C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）；所有試劑為分析純或色譜純。

實驗用菌種E. variecolor分離自中國南海采集到的海綿，菌種保藏于北京大學天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室。

2 提取與分離

菌株E. variecolor在經過30 d大米培養基發酵后，將大米發酵物充分破碎，用乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮后得到粗提物20 g，粗提物用80%甲醇混懸后用石油醚萃取3次，減壓回收甲醇水部位得到粗浸膏約10 g。粗浸膏首先用常壓ODS柱色譜分離，洗脫劑為30%，40%，50%，60%，70%甲醇梯度洗脫，得到5個流分（Fr.1～Fr.5）。Fr.3（5.2 g）再次進行硅膠 （200～300目，300 g） 柱色譜，以CH2Cl2CH3OH（100∶1，50∶1，30∶1，15∶1，10∶1）梯度洗脫，相同組分合并，得到6個流分（Fr.3.1～Fr.3.6），其中Fr.3.3為化合物3（1.8 g），Fr.3.5為化合物4（1.6 g），Fr.3.1（0.5 g）再經半制備液相 [CH3CNH2O（70∶30）] 色譜分離，得到化合物1（8 mg）和2（10 mg），Fr.3.4（180 mg）和Fr.3.6（160 mg）分別用半制備液相 [CH3CNH2O（70∶30）] 色譜純化，分別得到化合物5（52 mg）和化合物6（48 mg）。endprint

3 結構鑒定

化合物1 為白色粉末；[α]20D+ 40.1（c 1.15，MeOH）；高分辨電噴霧質譜（HRESIMS）顯示其準分子離子峰為m/z 221.079 5 [M+Na]+（計算值 C10H14O4Na，221.079 0），說明其相對分子質量為198，分子式為C10H14O4，不飽和度為4；首先，分析1HNMR圖譜，該化合物的氫譜與化合物dihydroterrein[12]非常相似，只多了1個甲基信號δH 2.11（3H，s，H10），可能為乙酰基的甲基，根據13CNMR和HMBC圖譜發現，H10與羰基碳（C9）有相關信號，可確定化合物中含有1個乙?；?，HMBC圖譜中，H2[δH 5.00（d，J=3.0 Hz）]與C9有相關信號，可確定乙?；ㄟ^氧原子與C2相連（表1）；化合物1的相對構型可根據H2與H3的偶合常數J=3.0 Hz來確定，可知H2與H3處于反式，絕對構型通過比較計算ECD與實測ECD來確定，C2與C3分別為R和S構型，命名為（+）2acetyldihydroterrein（圖2）。

4 討論

21世紀前，海綿一直是發現海洋天然產物的最主要生物來源[1620]，發現了許多化學結構新穎，生物活性顯著、作用機制獨特的功能小分子，其中的一些已經作為新藥候選先導化合物，處于臨床前或臨床研究階段；海綿共生真菌作為海綿宿主的重要組成部分，兩者互相協作，共同適應海洋復雜的生存環境，海綿為真菌提供營養物質和寄生產所，共生真菌為海綿抵御外來環境的威脅而釋放一些化學物質；海綿共生真菌體內蘊藏著巨大的生物合成基因簇，大力挖掘海綿共生真菌的天然產物合成潛力，是獲得活性化學成分的又一寶貴途徑，總之，海綿及其共生微生物是開發先導化合物的重要資源。

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[責任編輯 丁廣治]endprint