飼料中黃曲霉毒素B1快速篩查膠體金免疫層析檢測方法應用研究

劉曉玥+侯亞楠+呂麗卿

摘要：本文介紹飼料行業中黃曲霉毒素B1目前檢測方法的整體情況，并對優缺點進行分析，通過用膠體金免疫層析法和酶聯免疫吸附法對飼料樣品的檢測進行對比，結果表明：膠體金免疫層析試紙條法與酶聯免疫吸附法相符率可達95%以上，膠體金免疫層析試紙法操作簡單、快速、方便，可以應用于谷物及飼料產品黃曲霉毒素B1現場快速檢測。

關鍵詞：黃曲霉毒素B1；膠體金免疫層析法；試紙條；快速檢測

中圖分類號： R155；TS264 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.18.018

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）屬于真菌毒素（Mycotoxin），主要是由黃曲霉和寄生曲霉產生，廣泛存在于土壤、灰塵、植物及其果實上，常見于花生及其制品、玉米及其玉米副產物、棉籽以及一些堅果類食物和飼料中（其中以花生和玉米污染最嚴重）。AFT包括B1、B2、G1、G2等10多種，其基本結構為二呋喃環和香豆素，其中AFB1占80%～90%，毒性最強。1993年AFT被直接衛生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定為I類致癌物，其作用的靶器官主要為肝臟。世界各國對黃曲霉毒素在食品和飼料中限量要求。對于飼料企業每年收購玉米均以千噸來計，故黃曲霉毒素B1的篩查就顯得尤為重要，它要求采用的檢測手段，快速、準確、靈敏、易操作、設備投入小，通用型強等條件。

1 飼料檢測標準概述

縱觀有關黃曲霉毒素B1檢測國家標準規定的方法10余個之多，涉及到的行業有食品、乳制品、糧油、飼料行業，本文重點介紹飼料行業現行的國家標準共計6個，見表1。

根據試驗原理分為兩類：一類方法是對樣品進行快速篩查的定性和半定量方法；另一類方法是對樣品進行定量檢測的方法。

2 檢測方法優缺點概述

2.1 薄層色譜法——半定量法（TLC）

該方法的特異性較差，樣品中的其他熒光物質容易對檢測物質產生干擾，從而影響檢測結果的準確性，重復性較差。

2.2高效液相色譜法（免疫親和層析柱）（HPLC）

該方法由于抗體的專一性，黃曲霉毒素B1被交聯在層析介質中，因此方法專一性較強，實驗過程繁瑣，容易產生各種影響因素，造成檢測物質損失，儀器設備昂貴，要求操作人員具有專業高效液相色譜經驗，降低了推廣性。

2.3 熒光光度儀

簡單快速，靈敏度高、具有特異性。安全，不需要直接接觸黃曲霉毒素，不用毒素標樣，較少使用有機試劑。缺點：只能測出黃曲霉毒素的總量，不能分別測出其中B1、B2、G1、G2的含量；所用的水、試劑、儀器要求較高，水必須是高純水或重蒸水，試劑必須是分析純；需要專業儀器支持。

2.4時間分辨熒光層析法

靈敏度高，原理同ELISA一致，靈敏度和測量范圍方面，均超越了市場上常用ELISA，有較好的分析穩定性，具有很好的應用前景，但同時檢測過程比較復雜，所用試劑較多，需要使用標準品，給操作者帶來風險，同時需要有專業儀器支持，故設備投入需要較多資金。

2.5 酶聯免疫吸附法（ELISA）

該方法靈敏度高，分析速度快，簡化了提取和純化的步驟，其作為液相色譜法的初篩工具，不需要大型設備，對操作人員要求也不高，成本也相對較低，被廣泛推廣采用。

2.6膠體金免疫層析法 （GICA）

該方法靈敏度高、分析速度快、特異性強、穩定性好、操作簡單、無需任何專業儀器設備，無需接觸標準品，而且結果判斷直接可靠、容易被基層單位人掌握，最早廣泛應用于臨床診斷及藥物檢測等領域，近年來在谷物中毒素檢測領域被廣泛使用，作為谷物快速毒素篩查工作起到了十分重要的作用。

3 膠體金免疫層析法詳解（GICA）

3.1方法原理

這是20世紀80年代發展起來的一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和色譜層析技術相結合的快速檢測分析方法。該技術本質是免疫檢測技術，但充分利用膠體金作為示蹤標記物的優點。通常為雙抗夾心法和競爭法兩大類，其中競爭法又分為比色法和消線法兩種檢測。由于真菌毒素均為化學結構簡單的小分子，通常只需要1個表面決定小分子檢測，如激素、真菌毒素、抗生素的檢測等。所以，目前市場上膠體金免疫層析檢測試紙條絕大多數采用競爭法的原理進行檢測。

3.2 制備方法

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標記抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體并噴于玻璃纖維上，黃曲霉毒素B1偶聯抗原和二抗鼠抗驢分別結合于硝酸纖維膜上，依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維膜和吸水紙組裝切割成膠體金試紙條并裝入檢測卡中。測試結果表明，黃曲霉毒素 B1快速檢測試紙條的靈敏度為 5ng/ml，檢測時間為 10分鐘，批內和批間重復性為100%，假陽性率和假陰性率均為0。

3.3適用范圍

玉米、小麥等谷物類樣本，玉米副產品、飼料樣本等。

3.4技術指標

玉米、小麥等谷物類樣本最低檢測限：10цg/kg（ppb）。

玉米副產品、反芻飼料等樣本最低檢測限：20цg/kg（ppb）。

3.5注意事項

試劑板一次性使用；不要使用過期試劑板，廢棄物應妥善處理；請勿觸摸試劑板中央的白色膜面；切勿重復使用配備的滴管，以免交叉污染；切勿食用配備的試劑。

3.6特異性

本產品與糧油中玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、赭曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇沒有交叉反應。

3.7精密度

同時使用本產品和黃曲霉毒素B1的ELISA檢測試劑盒對300份樣品包括161份陰性樣本和139份陽性樣本進行檢測，結果表明，本產品與黃曲霉毒素B1的ELISA檢測試劑盒的結果符合率為98.8%。

4 數據對比

在實際工作中通過大量樣品對比，將膠體金免疫層析試紙檢測法和酶聯免疫吸附法進行對比，檢測數據見表2。

表2 谷物原料和飼料產品黃曲霉毒素B1檢測數據對比

通過上述數據對比，可以表明谷物原料和飼料產品使用膠體金免疫層析法檢測，結果具有很好的穩定性，與酶聯免疫吸附法的檢測結果一致。

5結論

膠體金免疫層析法優于酶聯免疫吸附測定法，具有假陽性率低、操作步驟少、操作過程影響因素少、測定結果重復性較好的優勢，因此提高了檢測效率，能滿足企業在現場快速篩查的需要。此外，高色素復雜基質的谷物采用酶聯免疫吸附法時容易出現假陽性，受樣品基質影響明顯，而樣品基質對金標免疫層析試紙法影響不明顯。雖然目前此方法還只能完成定性或半定量檢測任務，但作為一種快速篩查手段，可以有效地對谷物原料進行進廠后的初篩過程，其穩定性、安全性完全可以滿足企業對原料毒素控制要求，具有很重要的實際應用價值。

參考文獻

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作者簡介：劉曉玥，本科學歷，副高級工程師，研究方向：飼料品控管理；侯亞楠，化驗員，研究方向：飼料原料及產品毒素檢測；呂麗卿，本科學歷，化驗員，研究方向：飼料原料及產品毒素檢測。endprint