芬頓法深度處理生物處理排水中的四環素抗性基因

曾 萍,劉詩月,張俊珂,宋永會*,劉瑞霞,劉 洋(.中國環境科學研究院,城市水環境科技創新基地,北京 000；.中國地質大學(北京)水資源與環境學院,北京 0008；.中國礦業大學(北京)化學與環境工程學院,北京 0008；.阿爾伯特大學土木與環境工程系,加拿大 7-6)

芬頓法深度處理生物處理排水中的四環素抗性基因

曾 萍1,劉詩月2,張俊珂3,宋永會1*,劉瑞霞1,劉 洋4(1.中國環境科學研究院,城市水環境科技創新基地,北京 100012；2.中國地質大學(北京)水資源與環境學院,北京 100083；3.中國礦業大學(北京)化學與環境工程學院,北京 100083；4.阿爾伯特大學土木與環境工程系,加拿大 7-263)

以四環素抗性基因tet(L)、tet(E)為研究對象,考察了芬頓氧化技術對四環素抗性基因廢水深度處理的效果.采用定量PCR與DGGE技術檢測了芬頓法處理前后生物處理排水中的四環素抗性基因的豐度與廢水中菌群豐度的變化.結果顯示,在最佳反應條件:反應時間10min, pH值為5, [H2O2]/[ Fe2+](物質量的比)=8且H2O2的濃度達到0.2mol/L時, 16SrRNA及四環素抗性基因(tet genes)的去除效果最好.同時分析芬頓氧化前后的DGGE圖譜可知,細菌菌群間的豐度有了明顯的變化.相關性分析可知,各目標基因與單因素間、各目標基因之間,各樣品中目標基因含量的變化與DGGE條帶變化之間都沒有明顯相關性.結果表明,芬頓試劑可能不僅僅是通過削減單位水體中抗性菌的濃度來降低抗性基因濃度,還通過其他的方式來去除單位水體中的抗性基因的濃度,這還有待進一步研究證明.

四環素抗性基因；芬頓氧化；定量PCR；凝膠電泳；相關性分析

近年來,由于抗生素濫用而導致的大量耐藥性致病菌和抗性基因(antibiotic resistance genes, ARG)的出現已對環境產生了相當的影響.自Pruden[1]在 2006年首次將抗生素抗性基因作為環境中的新型污染物提出,國際上對 ARG在環境研究領域受關注的程度日益增加.作為目前使用最廣泛、用量最大的抗生素種類之一的四環素類抗生素,由其導致的ARB和ARG所產生的環境影響尤其受到人們的重視.目前,人們已在許多環境中分離得到多種ARB與ARG[2-3].如Pruden等[1]、Pei等[4]在美國北科羅拉多河和Cache La Poudre 河水及底泥中均檢測出四環素抗性菌(tet ARB)與四環素抗性基因(tet genes).在我國,太湖和長江南京段檢測到了整合子intI 1、2種tet genes(tet(A)和 tet(C))[5],北京溫榆河流域耐藥大腸桿菌對四環素的耐藥率為 5%～25%[6],珠江水域、海河流域、黃浦江、北江河等自然水體中也檢測出了tet genes[5,7-9].而作為ARG聚集地的醫院、養殖場和污水處理廠,其ARG的豐度更高,對人類健康的威脅也更加嚴重[10-17].劉苗苗等[18]研究發現,制藥廢水與城市污水排放口水樣中的總 ARB比例比排放口上游增加了 10～1000倍.吳楠等[19]對北京市的一家養豬廠進行了研究,檢測到了5種抗性基因(tet(B/P)、tet(M)、tet(O)、tet(T)、tet(W)),并在一定程度上說明了 ARG橫向轉移機制的存在.代敏等[20]對豬源沙門氏菌的四環素抗藥性進行了檢測,發現其耐藥率達到100%,而tet(C)的檢出率也達到75%.

已有的研究表明,污水處理廠中 ARG的分布與ARG種類及抗生素濃度有關,ARG的去除效果與工藝也有很大關系,甚至受處理系統參數的影響.Kim等[21]認為活性污泥本身對 ARB與 ARG去除的效果不明顯[21].Munir等[22]認為膜生物反應器(membrane bio-reactor, MBR)工藝比傳統活性污泥工藝具有顯著的 ARB與ARG的去除效果.Xia等[23]的研究結果表明,降低污泥停留時間(sludge retention time, SRT)可促使缺氧/好氧-MBR系統內細菌總數明顯下降,但ARG比例增加,而固定化缺氧/好氧-MBR系統內細菌總數與 ARG 量受水力停留時間(hydraulic retention time, HRT)影響較小.甚至還有一些研究表明[16,24-25],在污水處理過程中細菌通過自身基因突變和可動的遺傳因子的水平轉移獲得耐藥性,并在處理設施中逐漸積累耐藥性,使得ARG的豐度增加了.所以,目前污水處理工藝對ARB和ARG的去除效果還沒有一致的定論.

在傳統的污水處理工藝的基礎上,一些研究者對tet genes進行了深度處理,但研究結果不足以支持統一的結論.如采用垂直流人工濕地對豬場養殖廢水中抗性基因有明顯的處理效果[26];污泥的深度脫水后抗性基因的去除率均達到 80%以上[27];混凝劑對污水中tet(G)和tet(X)都有比較明顯的去除效果[28];采用次氯酸鈉消毒可以顯著降低出水中的抗性基因[3].而有的研究者發現次氯酸鈉和 UV 消毒工藝對去除出水中的抗性基因沒有顯著作用[22,29];加堿處理對污泥中的抗性基因沒有去除效果[30].

目前已有研究采用各種方法來處理 tet genes,但處理效果眾說紛紜,沒有得出一致的結論.作為高級氧化技術的芬頓法,一方面可以通過H2O2和Fe2+相互作用產生羥基自由基,氧化處理難降解廢水或一般氧化劑處理效果不明顯的廢水,另一方面又可以形成氫氧化鐵聚合物產生良好的絮凝效果.在氧化過程結束后,形成的膠體在絮凝沉降的同時會吸附水樣中存在的微生物碎片以及胞外存在的ARG,很好的將ARG從水相中去除.但是現階段,對芬頓法處理tet genes的研究還不充分.Cengiz 等[31]雖然較早的使用了芬頓試劑來處理畜牧場廢水中的 tet(M),但研究僅限于對處理后凝膠中 tet(M)條帶亮度的變化的分析,而缺乏對ARG去除的定量分析.本文選取了tet(L)、tet(E)為目標物,使用實時熒光定量PCR技術為研究手段,初步研究了芬頓法對 tet genes的處理效果,同時用變性梯度凝膠電泳(DGGE)表征了時間、pH及H2O2、FeSO4投加量的不同對四環素抗性基因廢水中群落的影響以及各單因素與16SrRNA、tet(L)、tet(E)、群落變化的相關性.

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

本研究所用樣品采自實驗室 SBR反應器.反應器流程如圖所示.反應器每4h進行1次排水和進水.樣品在每次采樣當天 06:00到 10:00循環的排水期前半個小時內采集.反應器出水使用滅菌玻璃瓶采集,采集后保存在 4℃冰箱里待用.水樣初始水質條件和初始基因定量結果如表1所示.

圖1 SBR反應器結構及運行流程Fig.1 Structure and process chart of SBR

表1 初始原水水質和目的基因含量Table 1 qualities and target genes of raw water

1.2 芬頓試驗方法

芬頓試驗選擇時間、pH值、H2O2用量、FeSO4.7H2O用量為變量,考察不同條件下抗性基因的變化.室溫下,取400ml樣品于1L滅菌燒杯中,用98%的濃硫酸調節pH值為設定初始值,加入一定量的H2O2(30%)和FeSO4.7H2O,在磁力攪拌下反應一定時間,然后用 5mol/L NaOH調節pH為11,靜置2h后,上清液pH值降至8.2～8.5.然后取上清液定容到250ml,過0.22um玻璃纖維濾膜(millipore, USA),從濾膜上提取DNA.

1.3 四環素抗性基因檢測和定量研究

1.3.1 樣品 DNA提取及目標基因檢測 樣品DNA 根據 E.Z.N.A?. Water DNA Kit(omega bio-tek,USA)試劑盒中的說明提取.使用微量紫外分光光度計( Nanodrop 2000, Nanodrop,USA)檢測提取的 DNA含量及純度,A260/280值在1.8～2.0之間,表明用試劑盒提取的DNA可以用于后續試驗.

1.3.2 目標基因檢測 選擇細菌 16SrRNA、tet(L)和 tet(E)作為目標基因.目標基因的檢測采用普通聚合酶鏈式反應(PCR)方式,在 PCR擴增儀(6325AG,Eppendorf,USA)中進行.25μL反應體系包括 12.5μL 的 Gotaq Green Master Mix 2X(promega, USA),濃度為 10μmol/L的引物各1μL,2μLDNA樣品和一定量的滅菌超純水.引物序列見表2.,其中細菌16SrRNA引物采用V3區通用引物F357/R518.

普通 PCR反應條件為:95℃預變性 7min, 95℃ 30s,退火30s(退火溫度見表1.),72℃ 1min, 40個循環,最后72℃延伸5min.普通PCR反應完后,用 2%的瓊脂糖凝膠電泳試驗來檢測目標基因,Marker為 50bp DNA step ladder (promega, USA).

表2 引物序列、退火溫度及產物長度[32]Table 2 primer sequence for 16SrRNA, tet(L), tet(E)

1.3.3 實時熒光定量PCR試驗 實時熒光定量PCR(Light Cycler 480Software Setup, Roche, Applied Science, Switzerland)的反應體系為20μL,其中包括10ulSybr Green qPCR Master Mix(SG Fast qPCR Master Mix(2X),BBI),上下引物(10μM)各0.4μL,ddH20 7.2μL,2μL DNA模板.定量PCR程序為:95℃ 3min,40個循環(95℃ 15s,退火20s,72℃ 30s),采用運行程序自帶的溶解曲線過程.兩種目標基因的標準曲線如圖2所示.

圖2 抗性基因的標準曲線(a) tet(L),(b) tet(E)Fig.2 Standard curves of antibiotic resistance gens (a) tet(L),(b) tet(E)

1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)及相似性分析

以芬頓試劑處理后DNA及原始水樣DNA為模板,利用細菌通用引物 F357-GC/R518(引物序列見表 2)在 16SrDNA保守基因片段經 PCR擴增,取PCR純化后的產物進行DGGE.凝膠變性梯度為 40%～60%,丙烯酰胺凝膠濃度為 8%, 100%變性劑由7mol/L尿素、40%甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺和TAE配制.樣品量為50 μL.樣品編號及相應處理條件如表 3所示.其運行條件為:1X TAE電泳緩沖液,電壓65V,60℃下運行16h.電泳完畢后用SYBR Gold(1×TAE, 1:10000) (Life Technology, Invitrogen, USA)染色45min,然后用去離子水漂洗.染色后的凝膠通過 D-Code凝膠成像系統(Bio-Rad,USA)拍照.使用Quantity One軟件對圖譜進行分析,按照UPGMA算法計算相似性系數(也叫戴斯系數 CS,Dice coefficient),其計算公式如下:

式中:j是樣品A和B共有的條帶,a和b分別是樣品A和B中各自的條帶數.依據沒有相同條帶到條帶完全相同,戴斯系數的范圍從0變化到1.

表3 芬頓反應的操作條件Table 3 The operation conditions of Fenton oxidation

2 結果及分析

2.1 芬頓試劑對四環素抗性基因的處理效果

(1)反應時間對抗性基因去除的影響

由圖3(a)可見,當反應1min、5min時,廢水中的16SrRNA的量顯著的降低了2～3個數量級.但對于 tet genes,其處理效果不太理想,當反應 1min、5min時,tet(L)沒有降低,tet(E)反而升高了.已有研究[33-34]表明,芬頓試劑產生的.OH的氧化能力極強,在已知氧化劑中只弱于 F2,常被用來處理難降解有機物以提高廢水的可生化性.本實驗中 tet genes在短時間處理后出現的升高的現象可能正是因為芬頓試劑破壞了微生物菌膠團結構,tet genes釋放出來,從而單位水溶液的基因拷貝數升高[35].這說明芬頓試劑作用時間較短,對 tet genes沒有明顯的去除效果.隨著時間的延長,在10min時,16SrRNA、tet(L)、tet(E)都得到了較好的去除,16SrRNA降低了3個數量級,tet(L)的去除率達到50%,tet(E)也降低了大約7%.而隨著反應時間繼續延長,由H2O2釋放出來的.OH逐漸被消耗以及 H2O2的自身無效分解,氧化能力降低,且吸附在氫氧化鐵聚合物上的微生物或tet genes又被釋放出來,使得濃度升高.

圖3 各種參數對芬頓反應處理四環素抗性基因的影響Fig.3 Effect of factors on the tetracycline resistance genes removal by Fenton oxidation(a)反應時間、(b)pH、(c) [H2O2]/[Fe2+]的比例(d)H2O2加入量

(2) pH對抗性基因的去除影響

按照經典的芬頓試劑反應理論,芬頓反應在一定的pH范圍內可以產生較多的.OH和Fe2+而具有較好的有機物礦化效果[35].pH 升高不僅抑制了.OH的產生,而且使溶液中的 Fe2+以氫氧化物的形式沉淀而失去催化能力;當 pH過低時,溶液中的 H+濃度過高,Fe3+不能順利地被還原為Fe2+,催化反應受阻.因此 pH的變化直接影響到Fe2+-Fe3+的絡合平衡體系,從而影響芬頓試劑的氧化能力.由圖 3(b)可見,pH 從 2增加到 5, 16SrRNA的去除率在 99.0%以上,tet(L) 的去除率從-50.0%經-40.0%變化到72.5%,tet(E)的去除率從94.5%經81.2%變化到94.8% .因此當pH等于5時,16SrRNA、tet(L)、tet(E)的去除率最高.

(3) [H2O2]/[ Fe2+]對抗性基因的去除影響

芬頓試劑處理廢水的有效性及經濟型主要取決于[H2O2]/[Fe2+](物質量的比)的值. FeSO4.7H2O是芬頓反應中的催化劑.在合適的Fe2+濃度范圍內,隨著 Fe2+的濃度增加,單位投加量的H2O2產生的.OH增加,且所產生的.OH全部參與了與有機物的反應;當Fe2+的濃度過高時,部分H2O2發生無效分解,釋放出O2.由圖3(c)可見,當[H2O2]/[Fe2+](物質量的比)從 5增加到 10時,16SrRNA的去除率保持在99.0%以上, tet(L)的去除率從負數變化到 60%,tet(E)的去除率從50%變化到10.0%.當[H2O2]/[Fe2+]為6.7時,tet(L)的去除率最高,達到 99.0%以上;當[H2O2]/[Fe2+]為8.0時,tet(E)的去除率最高,達到80.0%以上.綜合考慮三個指標,當[H2O2]/[Fe2+](物質量的比)為8.0時,16SrRNA、tet(L)、tet(E)的去除率最佳,分別達到99.3%,80.7%,80.5%.

(4) H2O2的投加量對抗性基因的去除影響

而在Fe2+含量一定的條件下,這種影響也就取決于H2O2的投加量.一般情況下,當H2O2的濃度過高時,部分的雙氧水會發生無效分解.而當 H2O2的濃度較低時,產生的.OH被全部利用.由圖3(d)可見,在Fe2+投加量為30mmol/L時,當H2O2的濃度達到0.2mol/L 時,即[H2O2]/[Fe2+](物質的量比)=6.7, 16SrRNA的量有了較明顯的降低,且tet(L)和tet(E)幾乎檢測不到.在其他濃度下,tet(L)達到較好的去除效果時,tet(E)在處理后含量反而增加;而當tet(E)達到較好處理效果時,tet(L)的去除效果不佳.

因此,當反應時間為 10min,pH=3,H2O2的濃度達到 0.2mol/L時,H2O2]/[Fe2+](物質量的比)為8.0時,16SrRNA及tet genes的去除效果最佳.

圖4 氧化、絮凝對抗性基因的去除作用Fig.4 The effect of oxidation and flocculation on the removal of antibiotic resistance genes

(5)氧化和沉淀在芬頓反應中對抗性基因的去除作用按照芬頓反應的經典理論,pH對芬頓去除抗性基因的影響很大.H2O2在酸性條件下,在亞鐵離子的催化下氧化目標物,然后通過加堿來終止反應,去除抗性基因作用包括氧化和絮凝兩個部分;而在堿性條件下,芬頓的反應體系中迅速生成了氫氧化鐵的絮體,這個過程由絮凝作用去除的抗性基因.通過堿性調節去除的抗性基因來計算酸性條件下絮凝和氧化對16SrRNA及tet genes的去除如圖4所示.對于16SrRNA,無論pH為2, 3或者5,氧化作用比絮凝作用對抗性基因的去除少3個數量級. pH為2, 3,5,tet (E)主要由絮凝作用去除.當pH為2, 3時,tet (L)主要由絮凝作用去除;當pH為5時,氧化作用去除了15.7%的tet (L),氧化作用去除了84.3%的tet (L).這同莊耀等(2014)報道的混凝作用對抗性基因的去除一致.因此,絮凝沉淀在芬頓反應去除抗性基因的過程中不可忽視.

2.2 芬頓氧化對樣品中微生物組成的影響

圖5 (a) 反應時間與反應pH單因素的DGGE圖譜Fig.5(a) DGGE profile of reaction time and reaction pH

圖5 (b) 反應時間與反應pH單因素的DGGE示意Fig.5(b) DGGE sketch map of reaction time and reaction pH

圖6 (a) H2O2與FeSO4.7H2O加入量的DGGE圖譜Fig.6(a) DGGE profile of H2O2and FeSO4.7H2O dosage

圖6 (b) H2O2與FeSO4.7H2O加入量的DGGE示意Fig.6(b) DGGE sketch map of H2O2and FeSO4.7H2O dosage

采用quantity one分析芬頓氧化前后抗性基因廢水中的微生物種群的變化(圖5和圖6),并進一步計算得到其與原水的相似系數列于表4中.由表4可知,當反應時間為1min時,樣品條帶與原水的相似度最高;在反應時間為10min時,相似度最低.當初始pH為3時,條帶相似度最低,而在pH為 2時,條帶相似度較高.這說明,在反應時間為10min和初始pH為3時,芬頓試劑對四環素抗性基因廢水的處理效果都很好,可以去除較多種類的微生物.同理,由表 4可知,當 H2O2和FeSO4·7H2O 的加入量分別為 0.1mol/L和 25mmol/L時,芬頓試劑對微生物的去除效果較好.在反應10min和pH=3時,芬頓試劑對微生物也具有較好的去除效果.而H2O2和FeSO4·7H2O的加入量的變化對微生物和基因的含量的影響有所不同,這可能是因為H2O2和FeSO4·7H2O可以進入到細胞內,破壞細胞的功能,從而使DGGE檢測到的微生物的多樣性降低.而具有較小片段的tet genes較難被氧化處理,需要較多的H2O2和FeSO4·7H2O[34].

表4 芬頓處理后水樣的DGGE條帶的相似性Table 4 Similarities of samples’ DGGE profiles after Fenton oxidation

2.3 樣品抗性基因與群落結構變化的相關性

為綜合考慮反應時間、初始pH、H2O2加入量、FeSO4.7H2O加入量對16SrRNA、tet(L)、tet(E)及DGGE的處理效果,利用SPSS軟件進行皮爾遜相關性分析,結果顯示各目標基因與單因素間呈不顯著相關(P＞0.05),且各目標基因之間也沒有明顯的相關性.各樣品中目標基因的變化與DGGE條帶之間也沒有明顯相關性.這說明,芬頓試劑不僅僅是通過削減單位水體中抗性菌的濃度來降低抗性基因濃度,還通過其他的方式來去除單位水體中的抗性基因的濃度.

3 結論

3.1 在 反 應 10min,pH=5,Fe2+投加量 為30mmol/L,H2O2的濃度達到 0.2mol/L, H2O2與Fe2+的物質量的比為 8,tet(M), tet(E)初始濃度為1.02和2.55log(copies/mL)時,16SrRNA及四環素抗性基因(tet genes)的去除效果最好.芬頓試劑對四環素抗性基因具有較好的去除效果,其在水樣中的絕對含量有較明顯的降低.

3.2 絮凝沉淀在芬頓反應去除抗性基因的過程中不可忽視.

3.3 芬頓氧化后四環素抗性基因廢水中的微生物種群數量有了明顯降低.各單因素對四環素抗性基因廢水中的微生物種群數量的影響沒有一致規律,需根據不同的處理對象具體分析.

3.4 芬頓氧化對四環素抗性基因與16SrRNA、DGGE圖譜條帶的處理間沒有顯著相關性,說明芬頓試劑對四環素抗性基因的去除不僅僅是通過削減單位水體中抗性菌的濃度,還有其他的方式.

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[34]Michael I, Hapeshi E, Michael C, et al. Solar photo-Fenton process on the abatement of antibiotics at a pilot scale: Degradation kinetics, ecotoxicity and phytotoxicity assessment and removal of antibiotic resistant enterococci [J]. Water Research, 2012,46(17):5621-5634.

[35]李春娟.芬頓法和類芬頓法對水中污染物的去除研究 [D]. 哈爾濱:哈爾濱工業大學, 2009.

《中國環境科學》2011～2014年發表的論文中20篇入選“領跑者5000”提名論文

《中國環境科學》2011～2014年發表的論文中有20篇入選“精品期刊頂尖論文平臺——領跑者5000”提名論文.“領跑者5000(F5000)”平臺由中國科學技術信息研究所于2013年建設,旨在集中展示中國精品科技期刊上發表的最高端的學術研究成果,將與國際和國內重要檢索系統鏈接,擴大論文影響.該平臺將與湯森路透公司合作,擬利用WOK國際檢索系統平臺,與SCI數據庫在同一平臺內實現文獻鏈接和國際引文檢索,在更大范圍內向世界科技同行展示和推廣中國最重要的科研成果.提名論文均為 2011～2014年在學科領域內被引率排名居前的論文.本次環境學科共有65篇文章入選“領跑者5000”提名論文.

advanced Fenton oxidation treatment of tetracycline resistance genes in effluent discharged from biological wastewater treatment.

ZENG Ping1, LIU Shi-yue2, ZHANG Jun-ke3, SONG Yong-hui1*, LIU Rui-xia1, LIU Yang4(1.Department of Urban Water Environmental Research, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China；2.School of Water Resources and Environment, China University of Geosciences, Beijing 100083, China；3.School of Chemical & Environmental Engineering, China University of Mining and Technology (Beijing), Beijing 100083, China；4.Department of Civil and Environmental Engineering, University of Alberta, Edmonton, Alberta, 7-263, Canada, China). China Environmental Science, 2017,37(9)：3315～3323

Fenton oxidation was used to remove tetracycline resistance genes (tet genes: tetL and tetE) from wastewater. Changes in the relative abundance of tet genes and the bacterial community structure were monitored using quantity polymerase chain reaction (q-PCR) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). The highest removal efficiencies for tetracycline resistance genes and 16SrRNA were achieved at the optimal conditions, including the reaction time of 10min, pH of 5, H2O2/Fe2+molar ratio of 8 and H2O2concentration of 0.2mol/L. DGGE analysis showed remarkable changes in the bacterial community diversities after Fenton oxidation. However, no significant correlation was observed either between the removal of tet genes and the parameters used in Fenton oxidation, or between the removal of tet genes and the change in the bacterial community structures. These results may suggested that the removal of tet genes may not only attribute to the removal of tetracycline resistance bacteria. Future investigations may be necessary to further understand the removal mechanisms in details.

tetracycline resistance genes；Fenton oxidation；quantity PCR；DGGE；correlation analysis

X703.1

A

1000-6923(2017)09-3315-09

2017-02-10

中央級公益性科研院所基本科研業務專項(2016YSKY-027);國家環境保護環境微生物利用與安全控制重點實驗室開放基金資助(MARC 2012D008)

* 責任作者, 研究員, songyh@craes.org.cn

曾 萍(1971-),女,重慶人,研究員,主要從事工業水污染控制方面的研究.發表論文80余篇.