珠三角河網地區糞便污染源解析

張 楊,吳仁人,張一敏,武兵文,吳孝情,陳中穎,李開明(1.武漢理工大學資源與環境工程學院,湖北 武漢 430070；2.環境保護部華南環境科學研究所,廣東 廣州 106；3.廣東省水與大氣污染防治重點實驗室,廣東 廣州 106；4.武漢科技大學資源與環境工程學院,湖北 武漢 430081；.浙江工商大學環境科學與工程學院,浙江 杭州 310000)

珠三角河網地區糞便污染源解析

張 楊1,2,吳仁人2,3*,張一敏1,4*,武兵文5,吳孝情2,3,陳中穎2,3,李開明2,3(1.武漢理工大學資源與環境工程學院,湖北 武漢 430070；2.環境保護部華南環境科學研究所,廣東 廣州 510655；3.廣東省水與大氣污染防治重點實驗室,廣東 廣州 510655；4.武漢科技大學資源與環境工程學院,湖北 武漢 430081；5.浙江工商大學環境科學與工程學院,浙江 杭州 310000)

準確識別水體中微生物污染物的宿主來源是進行針對性污染治理的基礎.應用實時熒光定量PCR(qPCR)技術篩選出適用于珠江三角洲河網地區的宿主特異性擬桿菌引物,并結合總細菌引物(BACT1369F/PROK1541R)、大腸埃希氏菌引物(EC23S857F/ EC23S857R)、擬桿菌通用引物(GenBac3F/GenBac3R)及糞大腸菌群(Fecal coliform)和大腸埃希氏菌(Escherichia coli)等常規水質指標對研究區域的水體進行分析,結果表明:人源(qHS601F/qBac725R)、牛源(BacB2-590F/Bac708Rm)、豬源(Bac41F/Bac163R)及雞源(qC160F-HU/qBac265R-HU)特異性擬桿菌引物在珠江三角洲地區同時具有較高的靈敏度和較強的特異性,適用于目標研究區域.選取的 14處城市地表水均受到糞便污染,污染源分別為人、反芻動物和禽類糞便.水體中各污染源強度為人源＞反芻動物＞雞源,其中人源特異性擬桿菌濃度與糞大腸菌群(Faecal coliform)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)及大腸埃希氏菌引物(EC23S857F/ EC23S857R)濃度具有較好的相關性(P＜0.05),說明人糞是各地表水中微生物污染的主要貢獻源.

實時熒光定量PCR；微生物污染；擬桿菌；特異性引物；珠江三角洲地區

隨著我國經濟的快速發展及城鎮人口的增加,市政污水的排放給自然環境帶來了極大的壓力.盡管加大了市政污水排放的管控力度,使其對環境的污染有了較大改觀,但市政污水造成的點源及面源污染仍然使一些城市河流、湖泊的水質逐漸惡化.其中,隨市政污水排入水體中的糞便污染源又是威脅人類健康的主要原因.例如,2011年廣東省各檢測點對廣東省各個地區所發生的水源性疾病統計結果顯示,報告的39316例病例中,其他感染性腹瀉病 35164例,所占比例高達89.44%;細菌性痢疾2794例,占7.11%[1].因此,對糞便污染城市水體的管控已刻不容緩.

糞便中的腸道致病菌是水源性疾病爆發的根源.世界上大多數國家,包括我國的地表水環境質量標準(GB3838-2002)[2]等通常都將糞大腸菌群或大腸埃希氏菌作為反映水體微生物污染狀況的指示微生物.然而已有研究表明,糞大腸菌與大腸埃希氏菌可能在適宜的自然環境中繁殖[3-4],影響對糞便污染水體程度的判斷,并且傳統指示菌不具備宿主特異性[5],不能判斷微生物污染來源.為準確識別水體微生物污染源強,國內外學者逐漸將目標指示菌由糞大腸菌群、大腸埃希氏菌等傳統指示菌轉向了多瘤病毒、甲烷短桿菌及擬桿菌等專性厭氧菌.它們均具有宿主特異性好、且不能在腸道環境外生存繁殖等特點.然而,多瘤病毒、甲烷短桿菌等分子標記雖然具有較好地特異性,可以準確識別微生物污染源,但由于在腸道中并非優勢菌群,因此檢出率較低,會導致低估水體微生物污染程度[6].而擬桿菌不僅具有專性厭氧、宿主特異性好等優勢[7],且為腸道中的優勢菌群[8],相比于其它指示菌,具有較高的檢出率,近年來得到了越來越廣泛的應用.例如,Oyafuso等[9]已在美國華盛頓州部分地區成功應用人及反芻動物的特異性擬桿菌標記物識別出水體中糞便污染來源.

但由于不同地區人及動物飲食習慣及所處地區環境氣候等的差異,導致寄居于腸道內的細菌相對豐度、菌群結構等發生變化,造成指示菌引物存在地區適用性的問題.例如,反芻動物特異性引物 CF128在歐洲各國均表現出較高的靈敏度(100%),但在葡萄牙部分地區特異性僅為41%,而在愛爾蘭部分地區其特異性卻高達96%[10].目前,國內關于引物地區適用性的研究普遍是通過PCR技術篩選出引物,再進行后續的定量實驗.然而,qPCR作為一種絕對定量技術,其靈敏度及特異性均優于 PCR.因此,通過 PCR技術挑選引物未必能完全驗證引物的特性,在對水體微生物污染進行定量分析時往往忽略這一問題.對此,本研究選取了人及常見畜禽動物體內的擬桿菌特異性引物,在珠江三角洲地區通過 qPCR技術對所選引物進行地區適用性驗證.同時,選取了廣州、珠海市的部分河段,分析不同來源的糞源微生物在城市水體中的濃度水平及與常規水質指標間的相關性,為后續開展微生物污染源解析及污染水平的定量分析奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器:核酸蛋白分析儀(DU730, BeckMan Coulter公司),紫外可見分光光度計(DR2800,HACH公司),冷凍離心機(Sigma公司),熒光定量PCR儀(LightCycler 480Ⅱ,Roche公司),多模塊基因擴增儀(FlexCycler2,耶拿公司), Quanti-tray 97孔定量盤(IDEXX公司),生化培養箱(三洋公司).

主要試劑:HiPure Stool DNA Kit B(D3141-02B,Magen公司),HiPure Water DNA Kit(D3145-02,Magen公司),SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司),瓊脂糖(Biowest,電泳級),COD低量程預制試劑(HACH公司),科立得試劑(IDEXX公司).

1.2 樣品采集

糞便樣品:2015年10月～2016年10月,在珠江三角洲地區東江和北江流域的多個畜禽養殖場內采集不同生物的糞便樣品,在廣州市醫院采集人糞樣品.糞便樣品數共計 140份,其中人 31份,雞20份,豬32份,狗14份,兔8份,牛28份,馬7份.樣品采集后保存于冰盒中,6h內送回實驗室進行后續處理.

水體樣品:對廣州市9處(G1～G9)、珠海市6處(Z1～Z6)地表水進行樣品采集,除Z1點在海港附近排污口處采集 3份水樣,其余各采樣點均在河道橫截面左、中、右處各采集一份水樣,共計45份水樣.所有樣品采集后進行編號并保存于冰盒中,于 6h內運抵實驗室進行后續實驗.各采樣點如圖1所示.

圖1 廣州、珠海地表水采樣點分布示意Fig.1 Distribution of sampling sites in Guangzhou and Zhuhai surface water

1.3 分析方法

1.3.1 水體中氨氮和 COD的測定 氨氮的監測采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009).COD的監測使用HACH公司低量程(LR)重鉻酸鉀法預制試劑.

1.3.2 固定酶底物法 采用100mL滅菌取樣瓶分別量取 100mL水樣,加入科立得試劑,混勻至試劑在瓶內完全溶解.將試劑混勻后的水樣倒入97孔定量盤內,用封口機封口.糞大腸菌群的培養放入(44.5±0.2)℃生化培養箱中培養,大腸埃希氏菌的培養放入(37.0±0.2)℃生化培養箱培養,24h后進行計數.

1.3.3 樣品處理及 DNA的提取 糞便樣品DNA的提取:采用Magen公司D3141-02B試劑盒,通過珠磨、懸浮、破碎及吸附柱純化等步驟從糞便樣品中提取 40～50μL DNA,具體操作步驟按試劑盒說明書進行.

水體中 DNA的提取采用 Magen公司D3145-02試劑盒,用0.22μm的濾膜過濾100mL水樣使菌體留在濾膜上,并按照說明書提取留在濾膜上的菌體DNA.DNA樣品置于-20℃冰箱儲存.

1.3.4 引物的選取及 qPCR分析 通過不同動物的糞便樣品DNA,對選取的具有宿主特異性擬桿菌引物進行擴增驗證.引物序列如表 1所示.qPCR擴增體系為 20μL:SYBR? Premix Ex TaqTM II(2×)(購自TaKaRa公司)10μL; ddH2O, 6.4μL;上下游引物各0.8μL;DNA模板2μL.qPCR擴增程序:①預變性,95 ℃ , 3 0s;②變性,95 ℃ , 5 s;③退火延伸,60 ℃ ,1min.40個循環.擴增體系與程序參照 TaKaRa公司 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ RR820A說明書.

1.3.5 引物靈敏度與特異性分析 采用以下公式分析各對引物的靈敏度(r)與特異性(s):r=[TP/(TP+FN)],s=[TN/(TN+FP)][23].其中,TP表示對自己種屬樣品擴增的陽性樣本數,FN表示對自己種屬樣品擴增的陰性樣本數;TN表示對其他種屬擴增的陰性樣本數,FP表示對其他種屬擴增的陽性樣本數.

1.3.6 標準曲線的制作 選取具有較高特異性及較強靈敏度的引物對提取的基因組DNA進行擴增,對擴增后的目標產物進行純化回收,連接到pMD 19-T Vector載體上,轉化DH5α感受態細胞,采用含有氨芐抗生素的平板培養基挑取陽性克隆,提取質粒 DNA,對其進行測序,并將基因序列提交至 GenBank進行同源性比對,BLAST結果顯示(未列出),人源1# (qHB )、牛源5#(qRB)、豬源9#(qPB)、雞源11#(qCB)特異性擬桿菌引物及擬桿菌通用引物 13#(qGB)、大腸埃希氏菌引物14#(qEC)與通用引物互補的序列均為各自目標菌株不同株系的16S rRNA基因片段,說明所選引物有較高的特異性.而總細菌引物15#(qTB)則含有變形菌屬、不動桿菌等其他多種菌株的核酸序列.同時,測定質粒DNA濃度,計算目的片段的拷貝數.將質粒 10倍梯度稀釋,稀釋 10-1,10-2, 10-3,10-4,10-5,10-6,10-77個梯度,并以此為模板,每個梯度作為標準品設3個重復,進行qPCR擴增.反應結束之后,進行標準曲線的制作.標準曲線的相關系數(R2)大于 0.99,結果可信.擴增效率(E)是通過標準曲線斜率來確定的,兩者符合公式E=10(-1/Slope)-1.如果一個反應的標準曲線斜率為-3.32,則該反應的擴增效率E=100%[24].一般認為擴增效率(E)在90%～110%之間是可接受的.

表1 特征生物標記引物Table 1 Primers used in qPCR assay

2 結果與討論

2.1 擬桿菌特異性生物標記的驗證

以各動物糞便中提取的 DNA為模板,選取已有的人、反芻動物、豬及雞源擬桿菌特異性引物進行 qPCR擴增.各引物擴增的統計結果及靈敏度和特異性分析見表2和表3.

采用人源特異性引物(1#～4#)分別對各糞便樣品進行qPCR擴增時,1#～4#引物特異性較強,但靈敏度除1#達到 100%以外,其他均較差.反芻動物引物(5#-8#)中,5#的靈敏度及特異性分別為92.9%和99.1%,效果較好.6#、7#引物特異性(均為88.2%)較強,但靈敏度(分別為78.6%和 46.4%)較差.8#引物的特異性較強(97.4%),而靈敏度僅 25%.對豬源擬桿菌特異性引物(9#、10#)驗證時,9#引物的靈敏度及特異性為93.8%和 96.4%,該引物的靈敏度較 10#引物高出71.9%.雞源特異性引物11#具有較好的靈敏度(85%)及較強的特異性(92.3%),分別比12#引物高出 25%和 11.2%.綜合以上結果,人源特異性引物1#(qHS601F/qBac725R)、反芻動物特異性引物5#(BacB2-590F/ Bac708Rm)、豬源特異性引物 9#(Bac41F/Bac163R)及雞源特異性引物 11#(qC160F-HU/qBac265R-HU)同時具有較高的靈敏度和較強的特異性,適用于目標研究區域.

表2 擬桿菌特異性引物的擴增結果Table 2 Amplification results obtained with specific Bacteroidales biomarkers

表3 擬桿菌特異性引物靈敏度與特異性分析Table 3 Sensitivity and specificity of the specific Bacteroidales biomarkers analyzed

PCR技術自出現以來,就因其特異性強、靈敏度高、操作簡便等特點而倍受青睞.但PCR技術須依賴一系列后處理過程對PCR終產物進行分析,這些處理過程可能會造成假陽性污染,同時針對PCR終產物進行處理分析也會干擾原始模板和終產物之間的定量關系[25].而在PCR基礎上發展而來的實時熒光定量 PCR(qPCR)技術則是利用反應體系中添加的熒光染料,通過積累熒光信號對整個擴增過程進行實時監測[26],相較于PCR技術而言具有更好的靈敏度和特異性,而且能夠避免后處理過程對擴增產物的污染,是一種絕對定量技術.目前國內大多數關于引物適用性的研究都是先通過 PCR定性分析,然后應用于qPCR進行定量.該方法忽略了PCR與qPCR技術之間靈敏度與特異性的差異,導致可能會在引物驗證階段使得部分適用引物被漏選.本研究為對比兩種方法驗證引物時的差異,分別通過PCR和 qPCR技術對采集到的 20個雞糞樣品采用11#(禽類)引物進行驗證,結果如表4所示.

表4 PCR及qPCR方法對雞源特異性引物的驗證結果Table 4 Chicken-specific primer verification resultsthrough PCR and qPCR method

引物的靈敏度及特異性是否符合目標研究區域目前仍沒有相應的標準,在進行微生物污染源解析時,不同引物在不同的區域內表現出的靈敏度、特異性及衰減特征都可能發生變化.Ahmed[27]在總結多種人源特異性擬桿菌引物效果時指出,當引物的靈敏度和特異性均大于 80%,該引物表現較好.若引物的靈敏度小于80%,而特異性大于 90%,該引物同樣可以接受.從表4可以觀察到,采用11#引物在20個雞糞樣本中通過PCR及qPCR方法得到的陽性樣本數分別為15個和17個,普通PCR驗證的靈敏度及特異性均小于80%,而qPCR驗證的靈敏度及特異性分別為85%和90.2%,適用于目標研究區域.說明qPCR方法較普通PCR而言,具有更高的檢出率,對不同引物的特異性擴增也更強,在引物驗證階段及后續的實際應用中,具有明顯優勢.

然而,采用qPCR作為驗證手段時,分析結果是以到達閾值的循環次數(Cq值)和熔解曲線為基礎,難以像普通PCR進行定性分析時具有簡單而統一的標準.例如,Shanks等[28]在微生物源解析研究中發現當引物 HF183/BacR287的 Cq= 33.5時達到了該引物的最低定量限(LLOQ),Cq＞33.5時由于DNA模板濃度過低而導致擴增結果的平行性較差.而引物 HumM2的 LLOQ則為Cq=34.7,說明不同引物的 LLOQ也不相同,這會給qPCR驗證造成一定的困擾.而本研究發現,當各引物的Cq值大于32.0時,會出現復孔之間Cq值誤差較大,甚至未能得到擴增結果等現象.因此,在本文所述的目標研究區域中,各引物可將Cq=32.0所對應的拷貝數作為最低定量限來驗證引物的特性.但這一標準是否適用于其它區域,尚須通過大量樣本進行驗證.

2.2 水體常規微生物與理化指標分析

對廣州、珠海的部分城市水體進行常規水質監測,結果如表 5所示.各采樣點所在河段(圖 1)均受到了不同程度的污染.在廣州市附近監測河段中,G1～G4采樣點COD、氨氮、糞大腸菌群濃度超標較為嚴重.尤其在 G4東塱采樣點周圍,存在繁華的商業區,人口較為密集,且有游船往來,其中氨氮已超出 V 類水質標準(GB3838-2002)2.5倍,糞大腸菌群(CFC)、大腸埃希氏菌(CEC)較G1～G3也高出1～2個數量級,說明G4點受糞便污染較為嚴重.G5～G8依次位于流溪河的上、中、下游,因此COD、氨氮的濃度分布特征總體呈現出沿河流方向逐漸增加的趨勢.河流末端G8采樣點的氨氮、COD濃度均已超出Ⅴ類水標準.然而G7處的CFC、CEC較G8高出1～2個數量級,更遠大于G6,這說明G7采樣點附近存在糞便污染源,并在河水的稀釋作用下,至G8點處污染程度已略有下降.G9位于廣州市中心區域,該河段常年受市政污水影響,各項水質指標超標嚴重,同時由CFC、CEC檢測結果可以看出,糞便污染可能是導致該區域水質較差的主要原因之一.

由于珠海市選取的Z1～Z5采樣點均位于排污口附近,因此各監測指標濃度較高.其中,鳳凰河排污口 Z1處污染最為嚴重,氨氮超出Ⅴ類水標準5.6倍,CFC較Ⅴ類水標準也高出2個數量級.此外,Z2～Z5水質也不容樂觀,均可列為劣Ⅴ類水質.值得注意的是,在雞啼門入海口處,當地居民為防止污水直接排入海灣,設立水閘將受污染河段與入海河段隔開.對比閘內、閘外的各項水質指標可以發現,閘外Z6采樣點的COD、氨氮較Z5分別下降了78.3%和98.8%,CFC、CEC也均減少了約3個數量級,符合Ⅱ類水標準.

糞便中含有大量的蛋白質、脂肪、N、P等營養物質.當未經處理的糞便進入地表水,糞便中N、P及部分有機質會通過腐敗分解等一系列過程殘留于水體中,對環境造成嚴重危害[29].因此,當水體受到糞便污染時,CFC、CEC等指示微生物的濃度可能與各項理化指標存在一定的關聯.本研究對DO、COD及氨氮三項指標與傳統指示微生物進行了相關性分析(見表 6),從中可以看出,CFC、CEC僅與氨氮具有較強的相關性.這是由于糞便中的 N元素大多以有機氮及氨態氮等形式存在,較易流失或侵蝕地表水,引起水體富營養化[30].然而,城市水體中的 N元素超標并非均由糞便排放引起,也可能存在N元素等營養物質由其它途徑排放至水體中,進而為CFC、CEC等兼性菌提供了生長條件,使得當水體中氨氮濃度較高時,CFC、CEC與氨氮表現出一定的相關性.而糞大腸菌群及大腸埃希氏菌在適當的營養環境中可能繁殖也是其作為指示菌的缺陷之一.因此,N、P等營養元素與CFC、CEC之間的相互作用關系,尚須通過對傳統指示菌在不同營養水 平下的衰減規律來進一步分析.

表5 各采樣點的水質指標Table 5 Water quality indicators for different sampling points

表6 傳統指示微生物與理化指標的相關性分析Table 6 Correlations analysis between traditional fecal indicators and physic-chemical index

2.3 水體中微生物污染的定量源解析特征分析

當糞便進入地表水中,由于稀釋作用導致擬桿菌濃度隨著水流的遷移而下降.同時,擬桿菌專性厭氧的特性也會使其在水體中快速衰減,因此擬桿菌作為指示菌通常用于評估近期污染.但在城市水體中,由于人糞可能來自于未經處理的生活污水、市政管道的污水溢流或污水處理廠等多種途徑[31],使得人源特異性擬桿菌可以維持在較高濃度水平.從圖2可以觀察到,qHB濃度較qRB平均高出1～2個數量級,較qCB高出2～4個數量級,說明各水體主要受到人糞污染較為嚴重,這也與城市水體主要接納生活污水及市政污水的實際情況相符.而各采樣點檢測到的qRB、qCB也表明水體同時受到反芻動物、禽類糞便的污染.但在實際采樣過程中發現,除G5、G6及Z4、Z5、 Z6附近有部分養殖場及耕地外,其余采樣點所在河流兩旁主要為商業區、居民區,這說明水體中的qRB、qCB可能為上游污染源遷移而來.

圖2 各采樣點指示微生物濃度Fig.2 Indicator microorganisms’ concentration in the each water body

理想的宿主特異性標記應在污染區域濃度較高,同時與傳統指示微生物(CFC、CEC)在腸道外的生存狀態(或衰減規律)具有一定的相似性[32].由傳統指示微生物和特異性擬桿菌的相關關系可以看出(表7),除qCB與CFC、CEC相關性較差,傳統指示微生物與各特異性擬桿菌引物及總擬桿菌均具有良好的相關性.其中,位于較高濃度水平的qHB與qEC、CFC及CEC的相關性最好,再結合各特異性標記在水體中濃度的大小(qHB＞qRB＞qCB),可以說明水體中宿主特異性標記物的濃度水平越高,與傳統指示微生物的相關性越強.這也反映出在以人糞污染為主的區域內,qHB作為源解析指示菌的有效性.

基于微生物污染源解析費用較高,研究者們認為可以先通過傳統指示微生物初步判定水體微生物污染程度,必要時再采用源解析方法確定糞便污染來源,為水體的針對性治理做出引導[33].然而,若對傳統指示微生物和特異性擬桿菌標記進行同步監測,利用二者在環境中衰減特征的差異,可以較為全面的分析出污染源源強[34],污染源距監測點的距離以及初步判斷污染源排放的時間段[32].例如,已有研究表明,大腸埃希氏菌等傳統指示微生物在環境水體中的衰減速率相比擬桿菌而言較為緩慢,可較持久地反映出微生物污染水平.而擬桿菌一旦進入環境水體中,會呈現出快速衰減的趨勢[35],之后在相對較低的濃度水平下維持 2～6d[32].對照本研究中糞源微生物的檢測結果,可以發現 qCB濃度水平已接近其 LLOQ.而qRB盡管較qCB高出1個數量級,但濃度也相對較低,同時由表 7觀察到特異性擬桿菌標記與傳統指示微生物(qEC、CFC、CEC)的相關性強度為qHB＞qRB＞qCB.綜合以上特征,可以判斷出水體中的反芻動物、禽類糞便為近期排放,并且排放點距監測點距離較遠,對監測河段水質影響較小.而人糞污染源鄰近各監測點,且排放量較大.

表7 傳統指示微生物與特異性擬桿菌的相關性分析Table 7 Correlations analysis between traditional microorganism indicators and specific bacteroides

3 結論

3.1 識別出基于qPCR技術的人源1#、反芻動物5#、豬源 9#及雞源11#擬桿菌特異性引物在珠三角河網地區具有較高的靈敏度及較強的特異性.

3.2 CFC、CEC這2種指示微生物的濃度與氨氮具有較好的相關性(P＜0.05),并且其指示結果與常規理化指標的評價結果基本吻合,能夠反映出水體受市政污水的污染狀況.

3.3 14處城市地表水均受到糞便污染,3種不同來源的糞便對水體的污染強度為 qHB＞qRB＞qCB,人糞為主要污染源.

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Microbial source tracking of fecal contamination in the Pearl River Delta region.

ZHANG Yang1,2, WU Ren-ren2,3*, ZHANG Yi-min1,4*, WU Bing-wen5, WU Xiao-qing2,3, CHEN Zhong-ying2,3, LI Kai-ming2,3(1.College of Resources and Environment Engineering, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China；2.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510655, China；3.The key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou 510655, China；4.College of Resources and Environment Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, China；5.School Environmental Science and Engineering, Zhejiang GongShang University, Hangzhou 310000, China). China Environmental Science, 2017,37(9)：3446～3454

Identification of the host source of microbial contaminants accurately is the basis for targeted treatment in water. To analyze the feature of pollution in the Pearl River Delta Region, qPCR method was applied to choose the suitable specific bacteroides primer, and culture-method was combined which detected the Fecal coliform and Escherichia coli to assess the water quality and the sources of fecal pollution in target area. The results showed that human-specific marker qHS601F/ qBac725R, ruminant-specific marker BacB2-590F/Bac708Rm, porcine-specific marker Bac41F/Bac163R and chicken-specific marker qC160F-HU/qBac265R-HU had higher sensitivity and specificity in the Pearl River Delta region. 14 sampling sites were polluted by human, ruminant and poultry fecal. The intensity of pollution by different source was found to be human＞ruminant＞poultry. And the concentration of qHS601F/qBac725R had a significant correlationship with Fecal coliform, Escherichia coli and EC23S857F/ EC23S857R (P＜0.05).It reflects that the major contribute of pollutant source was human.

qPCR；microbial pollution；bacteroides；specific markers；Pearl River Delta region

X713

A

1000-6923(2017)09-3446-09

2017-03-07

國家自然科學基金項目(41303054),中央級公益性科研院所基本科研業務專項

* 責任作者, 副研究員, wurenren@scies.org; 教授, zym126135@126.com

張 楊(1988-),男,寧夏銀川人,武漢理工大學與環境保護部華南環境科學研究所聯合培養碩士研究生,主要從事環境微生物研究.