不同營養狀態老年胃癌患者的二肽轉運載體1蛋白表達及調控機制

延 芳

(石河子大學醫學院第一附屬醫院臨床營養科，新疆 石河子 8320002)

不同營養狀態老年胃癌患者的二肽轉運載體1蛋白表達及調控機制

延 芳

(石河子大學醫學院第一附屬醫院臨床營養科，新疆 石河子 8320002)

目的探討不同營養狀態老年胃癌患者的二肽轉運載體(PEPT)1蛋白表達及調控機制。方法胃癌患者42例，根據營養風險篩查2002評分結果分為無營養風險組(評分<3分)31例，有營養風險組(評分≥3分)11例。術中取小腸黏膜標本，Western印跡法檢測PEPT1蛋白表達水平；酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清腫瘤壞死因子(TNF)-α濃度。取人結腸腺癌SW1116細胞，分別用不同濃度(20、50、100 μg/L )的TNF-α干預，于不同時間點(24 h、48 h、72 h)檢測SW1116細胞中蛋白表達水平。結果患者Lauren分型、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期與小腸組織中PEPT1蛋白表達的關系均無統計學意義(P>0.05)；有營養風險組患者的小腸組織中PEPT1蛋白表達水平明顯高于無營養風險組(P<0.01)。有營養風險組患者血清TNF-α濃度明顯高于無營養風險組(P<0.05)；胃癌患者小腸組織中PEPT1蛋白表達水平與血清TNF-α濃度呈正相關(r=0.851,P<0.05)。20、50、100 μg/L TNF-α處理24 h的SW1116細胞PEPT1蛋白表達水平均明顯高于空白對照組(P<0.05)；50 μg/L TNF-α分別處理24 h、48 h、72 h的SW1116細胞PEPT1蛋白相對表達量均明顯高于空白對照組(P<0.05)。結論有營養風險的老年胃癌患者小腸PEPT1蛋白表達上調，其機制與TNF-α調控作用有關。

二肽轉運載體；胃癌；營養風險篩查2002；腫瘤壞死因子

胃癌患者長期進食困難，根治術前多數存在不同程度的營養不良，因手術創傷大，術后較長時間的禁食和應激狀態，機體代謝率增加的同時無法獲得足夠的營養，導致患者營養狀況進一步惡化〔1〕。營養不良不僅損害胃癌患者組織臟器功能，還會降低免疫力，延長手術傷口愈合時間，增加感染率，影響治療預后〔2〕。相關研究顯示，蛋白質消化產物主要以二肽形式被吸收，其轉運和攝取功能主要依賴腸道上皮細胞中的二肽轉運載體(PEPT)1〔3〕。本研究擬探討患者不同營養狀態與小腸組織中PEPT1蛋白表達的關系，并通過體外細胞實驗進一步分析相關細胞因子的調控機制。

1 材料與方法

1.1病例與標本 選取2016年1～10月石河子大學醫學院第一附屬醫院普外科收治的胃癌患者42例。篩選標準：①年齡≥60歲，病理確診為胃癌，簽署知情同意書；②術前未接受放化療和營養支持；③無明顯消化道出血，心肺功能障礙。根據歐洲腸外腸內營養學會(ESPEN)推薦的營養風險篩查2002評估表將入選患者分為無營養風險組(評分<3分)31例，有營養風險組(評分≥3分)11例。術前采集患者肘靜脈血，室溫下凝血40 min，2 000 r/min離心20 min，分離上層血清。術中切除上段小腸黏膜組織，-80℃保存待測。

1.2主要試劑 人結腸腺癌SW1116細胞購于上海拜力生物科技有限公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海索寶生物科技有限公司)；山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(上海倍卓生物科技有限公司)；羊抗人PEPT1一抗，兔抗羊PEPT1二抗(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)；人腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1小腸黏膜組織中PEPT1蛋白表達檢測 取200 mg組織標本放入2 ml EP管中，加RIPA蛋白裂解液200 μl，4℃恒溫10 000 r/min離心20 min，收集上清蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。常規行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉移至聚偏二氟乙烯濾膜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉液沖洗后滴加羊抗人PEPT1一抗(1∶1 000稀釋)，兔抗羊PEPT1二抗(1∶500稀釋)，洗滌后曝光，Image J軟件分析目標條帶吸光度值。

1.3.2血清TNF-α濃度檢測 將試劑盒穩定平衡至室溫，按說明配置工作液、標準品。將稀釋后的不同濃度標準品和標本加入96孔板中，設置空白對照孔，37℃ 靜置60 min，棄去液體，磷酸緩沖液沖洗，滴加生物素標記的抗體，37℃ 靜置60 min，沖洗后滴加稀釋的酶結合物工作液，37℃ 靜置20 min。加顯色劑暗室反應20 min，終止反應，檢測450 nm處吸光度值。

1.3.3SW1116細胞PEPT1蛋白表達檢測 常規復蘇SW1116細胞，間隔72 h后分裝4個培養瓶進行傳代培養，分別滴加20、50、100 μg/L TNF-α，并設置空白對照，混合均勻后孵育24 h。再次復蘇SW1116細胞，50 μg/L TNF-α分別處理24 h、48 h、72 h，并設置空白對照。將上述細胞培養液10 000 r/min離心10 min，Western印跡法檢測SW1116細胞不同時間和不同濃度TNF-α處理后PEPT1蛋白表達水平。

1.4統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗、F檢驗；相關性進行Pearson分析。

2 結 果

2.1患者臨床指標與小腸組織中PEPT1蛋白表達的關系 胃癌患者Lauren分型、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況、TNM分期與小腸組織中PEPT1蛋白表達的關系均無統計學意義(P>0.05)；有營養風險組小腸組織中PEPT1蛋白表達水平明顯高于無營養風險組(P<0.01)。見表1，圖1。

2.2患者血清TNF-α濃度與PEPT1蛋白表達的關系 有營養風險組血清TNF-α濃度均值〔(0.24±0.09)μg/L〕，明顯高于無營養風險組〔(0.18±0.05)μg/L，P<0.05〕。胃癌患者小腸組織中PEPT1蛋白表達水平與血清TNF-α濃度呈正相關(r=0.851，P<0.05)。

表1 胃癌患者臨床指標與PEPT1蛋白表達的關系

1、2：有營養風險組；3、4：無營養風險組圖1 小腸組織中PEPT1蛋白表達情況

2.3TNF-α處理的SW1116細胞中PEPT1蛋白表達 20、50、100 μg/L TNF-α處理24 h的SW1116細胞PEPT1蛋白相對表達量分別為0.69±0.17、0.75±0.20、0.86±0.24，均明顯高于空白對照組的0.57±0.13(P<0.05)，見圖2。

1：空白對照組；2：20 μg/L TNF-α；3：50 μg/L TNF-α；4：100 μg/L TNF-α圖2 不同濃度TNF-α作用后的SW1116細胞 PEPT1蛋白表達情況

50 μg/L TNF-α分別處理24、48、72 h的SW1116細胞PEPT1蛋白相對表達量分別為0.51±0.13、0.72±0.25、0.91±0.32，均明顯高于空白對照組的0.43±0.08(P<0.05)。見圖3。

1：空白對照組，2：作用24 h，3：作用48 h，4：作用72 h圖3 50 μg/L TNF-α不同作用時間后的SW1116 細胞PEPT1蛋白表達情況

3 討 論

PEPT1為依質子的寡肽轉運體超家族成員，編碼hPEPT1的cDNA和氨基酸蛋白，相對分子量約為78 000 kD。PEPT1為氫離子依賴性具有低親和力和高容量的寡肽轉運體，多表達于小腸黏膜上皮細胞，為二肽等蛋白質產物吸收的主要環節〔4〕，病原菌、胰島素、miRNA等多種因素均可影響其表達水平〔5〕。本次研究提示PEPT1蛋白表達水平與老年胃癌患者營養狀況相關。短腸綜合征等腸道慢性病老年患者中均存在結腸PEPT1蛋白表達水平上調，同時合并TNF-α、TNF-γ等促炎性細胞因子表達水平增加〔6〕。在炎性腸道疾病患者中，TNF-α、TNF-γ炎性因子的表達水平也增加，且相關研究顯示，TNF-γ可有效提升人小腸組織中PEPT1蛋白表達水平和運輸能力〔7〕。體外細胞學研究顯示，TNF-α干預人結腸腺癌SW1116細胞可明顯提升細胞中PEPT1蛋白表達水平。胃癌患者中能否通過TNF-α干預PEPT1蛋白表達，進而改善營養狀況，仍需要進一步證實。

本次研究發現，有營養風險的老年胃癌患者小腸組織中PEPT1蛋白表達上調；可在術前對該類患者進行營養風險篩查評分，對有營養風險的老年患者有針對性地設計腸外或腸內營養支持。

1王佳銘，曹春遠，馬 震，等.老年胃癌患者20例圍術期腸內營養支持〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(19)：4278-9.

2楊叢蓮.奧沙利鉑黃芩素聯合應用對胃癌細胞抑制作用的影響研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2016；17(5)：640-3.

3劉 羽.應用蛋白質組學技術鑒定胃癌分化相關蛋白及Serpin B1表達與機制的研究〔D〕.石家莊：河北醫科大學，2012.

4鐘武裝，肖麗萍，蔡敏捷，等.早期腸內營養對老年胃癌患者術后免疫功能的影響〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(2)：280-2.

5王 穎.長鏈非編碼RNA DMTF1v4(NR_024549)在胃癌多藥耐藥中的作用及機制研究〔D〕.西安：第四軍醫大學，2012.

6楊勵勵.2010-2013年錦州市居民惡性腫瘤死亡原因分析〔J〕.中國衛生工程學，2016；15(1)：75-6.

7梁 好.胃癌、食管癌的病因學研究和環境危險因素人群歸因危險度的評價〔D〕.北京：協和醫學院，2012.

〔2017-06-16修回〕

(編輯 袁左鳴)

R73

A

1005-9202(2017)18-4572-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.064

延 芳(1980-)，女，碩士，主治醫師，主要從事臨床營養研究。