藏綿羊FAM134B基因克隆與表達分析

李文麗，杜曉華，劉 霞，，高景波，申超超，張 超，劉 偉

(1.甘肅農業大學 生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅 蘭州 730070； 3.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070)

藏綿羊FAM134B基因克隆與表達分析

李文麗1，2，杜曉華2，3，劉 霞1，2，*，高景波1，2，申超超1，2，張 超1，2，劉 偉1，2

(1.甘肅農業大學 生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅 蘭州 730070； 3.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070)

采用RT-PCR技術克隆了藏綿羊FAM134B(family with sequence similarity 134， member B)基因，利用生物學軟件進行相關生物信息學分析，同時用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR， qRT-PCR)研究組織表達水平。克隆獲得FAM134B基因全長1 144 bp (GenBank登錄號: KX580309)，開放閱讀框1 071 bp，編碼356個氨基酸。系統進化樹表明，藏綿羊FAM134B和綿羊、山羊關系較近。藏綿羊FAM134B基因編碼蛋白的分子式為C1717H2696N448O572S12，分子量為39 151.72 u，理論等電點(pI)為4.49，消光系數為24 450，不穩定系數為43，疏水指數為80.31，平均親水性為-0.422，屬不穩定可溶性酸性蛋白質。二級結構主要是α-螺旋(45.51%)、無規卷曲(41.85%)和延伸鏈(12.64%)，屬于混合類蛋白質。亞細胞定位和功能分析結果顯示，FAM134B編碼的蛋白在內質網、細胞質膜概率分別為30.4%和21.7%，主要在蛋白質運輸和結合(77.3%)方面起作用。系統發育樹表明，藏綿羊FAM134B氨基酸序列與綿羊、山羊同源性非常高。qRT-PCR結果表明，FAM134B基因網胃中表達最高，十二指腸表達量最低。研究結果可為進一步研究藏綿羊FAM134B基因結構和生理功能及其遺傳特性提供理論依據。

藏綿羊；FAM134B基因；CDS區克隆；生物信息學分析；表達

FAM134B(family with sequence similarity 134，member B)是最近發現的一種功能基因，其具體的功能還不是太清楚。Kurth等[1]研究發現FAM134B基因調控自主神經元以及疼痛感知神經元。此外，FAM134B基因在人食道鱗狀細胞癌變機理方面有著非常重要的意義[2]。高爾基體在蛋白質加工修飾方面起著重要作用，FAM134B基因缺失會導致出現新的高爾基體蛋白影響高爾基體的功能和脂質的合成[2]。袁章琴等[3]研究FAM134B基因極有可能與脂肪沉積相關，推測可以通過調控FAM134B的表達來調控脂肪的沉積。藏綿羊(Tibetan sheep)主要分布于我國青藏高原及與其毗鄰的川、滇、甘等高寒地區，具有良好的肉用價值。朱武政等[4]研究發現，FAM134B基因在山羊肌內脂肪沉積方面起著重要作用，這為肉質品質改良奠定了理論基礎。目前，國外針對FAM134B基因的研究尚處于起步階段，且主要集中在人、鼠上，國內也僅見對豬、牦牛、黑山羊FAM134B基因研究的相關報道[3-5]，對于高原特色動物藏綿羊FAM134B基因的研究尚未見報道。

本研究旨在克隆藏綿羊FAM134BCDS區，分析基因結構特點，探索藏綿羊FAM134B基因結構和生理功能，豐富藏綿羊FAM134B基因的遺傳信息數據，進一步揭示藏綿羊FAM134B基因的遺傳特性。

1 材料與方法

1.1 材料

從甘肅省甘南藏族自治州合作市采集藏綿羊大腦枕部、腦干、直腸、松果體、脾臟、肝臟、結腸、十二指腸、盲腸、結腸、網胃、回腸，將其快速切下，放入裝有RNA凍存液小管中，再迅速放入液氮中，拿到實驗室-70 ℃保存。

1.2 主要試劑

組織RNA凍存液、RNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；RNase-Free ddH2O、TaKaRa反轉錄試劑盒、DL2000 DNA marker和pGM-T克隆載體試劑盒購自北京天根生化科技公司； IPTG 及 X-Gal 購自 Amersco公司；Trans-5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；TaKaRaTaq酶購自北京百泰克生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1 藏綿羊大腦枕部組織總RNA提取及RT-PCR反應

用RNA試劑盒提取藏綿羊大腦枕部組織總RNA，用紫外分光光度計與1%瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測。按反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-70 ℃保存。

1.3.2 引物設計

根據GenBank中綿羊FAM134B基因序列(登錄號：XM_004017080.1)，用Primer3.0在線軟件設計特異性引物，預計擴增大小1 100 bp；引物序列如表1所示：

1.3.3 PCR擴增

總反應體系25 μL：上下游引物各1 μL，RNase-Free ddH2O 12 μL，Taq酶10 μL，cDNA模板1 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸65 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 目的片段TA克隆與鑒定

用膠回收試劑盒回收目的片段，在4 ℃條件下過夜連接 pGM-T克隆載體；連接產物轉化至Trans-5α感受態細胞，培養數小時后挑取白色陽性單克隆菌落，再進行菌液PCR 鑒定。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選陽性菌液送金斯瑞股份有限公司進行測序。

表1引物信息

Table1Primer information

目的基因Targetgene引物序列(5'～3')Primersequence片段Fragment/bp用途PurposeFAM134BF:GCAGAAATGCCTGAAGGTGA1144擴增FAM134BcDNA片段R:TTGGTAGTTTGTGCTCTGTCFAM134BcDNAfragmentamplificationFAM134BF:CACAGAGAAGAAGTCAGCAG171實時熒光定量PCRR:TTCAAAGTCATCGCCCTCCTqRT-PCRGAPDHF:GCAAGTTCCACGGCACAG118實時熒光定量PCRR:TCAGCACCAGCATCACCCqRT-PCR

GAPDH: 3-磷酸甘油醛脫氫酶

GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenas

1.3.5 序列生物信息學分析

使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)[6]、NCBI的ORF Finder[7]分析進行基因閱讀開放框分析，用Protfun(http://www. cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)在線軟件對FAM134B基因的功能進行預測分析[8]用PredictProtein和(http://www.predictprotein.org)[9]、SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)[10]等分析軟件與Lasergene7.1軟件包中的

Editseq軟件[10]和protean軟件[11]，PHD軟件[12]分析FAM134B的理化性質以及一級結構、二級結構、三級結構進行預測分析；利用Graph Pad Prism5軟件[13]分析熒光定量PCR結果；使用Lasergene7.1軟件中的MegAlign軟件[14]進行同源性分析及構建系統進化樹；使用在線亞細胞定位工具PSORT II Prediction(http://psort.hgc.jp/ form.html)[15]預測蛋白質的亞細胞定位。

1.3.6 藏綿羊FAM134B基因mRNA在不同組織的表達分析

選3-磷酸甘油醛脫氫酶 (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參基因，再根據藏綿羊FAM134BcDNA片段，設計一對熒光引物設計內參基因引物(表1)。20 μL PCR 擴增體系包括：Taq酶10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 7.8 μL，采用ABI熒光定量PCR儀進行定量分析。熒光定量PCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸5 min，40個循環。

2 結果與分析

2.1 藏綿羊FAM134B基因總RNA檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測藏綿羊大腦枕部組織總RNA，得到兩條帶，分別為28S rRNA、18S rRNA，并且28S的亮度是18S的2倍，5S rRNA很弱，幾乎看不到(圖1)；所測定的D260/D280為1.8～2.0，無蛋白質和DNA污染，RNA完整性較好。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測藏綿羊大腦枕部RT-PCR擴增產物，出現單一目的DNA條帶，條帶清晰明亮(圖2)，紫外燈下切膠回收，用于克隆測序。將克隆后的陽性菌液[16]用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，送公司測序，獲得藏綿羊FAM134B基因CDS區序列，提交至GenBank(登錄號：KX580309)。

2.2藏綿羊FAM134B基因CDS區核苷酸序列、編碼氨基酸序列以及開放閱讀框分析

參考Kozak法則[17]，利用NCBI的ORF Finder 分析藏綿羊基因CDS序列，得到長1 144 bp的ORF，起始密碼子ATG位于22 bp處，終止密碼子TAG位于1 092 bp處。通過軟件分析得到A=28.94%，G=24.74%，T=23.53%，C=22.78%。共編碼356個氨基酸殘基(圖3)。

圖1 藏綿羊大腦枕部組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel check of total RNA from Tibetan sheep occipital lobe of brain

M， DL2 000 DNA marker; 1， PCR擴增產物; 2， DNA純化回收; 3， 菌液PCRM， DL2 000 DNA marker; 1， The PCR amplicons; 2， Purification recycling DNA; 3， The amplicons of bacteria liquid PCR圖2 藏綿羊FAM134B基因RT-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel check of RT-PCR amplicons of FAM134B gene in Tibetan sheep

2.3藏綿羊FAM134B基因編碼蛋白的理化性質分析

用Prot Param軟件和DNA star軟件包中的Edit Sequence軟件預測蛋白質的理化性質，主要包括氨基酸組成、分子式、相對分子質量、等電點、消光系數、半衰期、疏水性等[18]。結果表明：

藏綿羊FAM134B編碼的蛋白由356個氨基酸殘基組成，分子式為C1717H2696N448O572S12，分子量為39 151.6 u，理論等電點(pI)為4.49，說明該蛋白為酸性蛋白質。在氨基酸殘基中Leu(12.64%)、和Ser(11.24%)的頻率較高，極性氨基酸占28.37%，疏水性氨基酸占31.74%，帶電氨基酸占31.46%，其中包括 17.13%的酸性氨基酸及9.27%的堿性氨基酸(表2)。預測其消光系數(γ=280 nm)為24 450，不穩定系數為43，屬不穩定類蛋白質[19]。在哺乳動物網織紅細胞內的半衰期為30 h[20]，平均親水性為-0.422，疏水指數為80.31，屬可溶性蛋白[21]。

2.4藏綿羊基因編碼蛋白的二級與三級結構預測

預測分析蛋白質的二級結構有助于認識蛋白的空間結構[22]。使用PHD軟件預測藏綿羊基因編碼蛋白的二級結構，結果表明，藏綿羊FAM134B主要是由α-螺旋(alpha helix)和延伸鏈(extended strand)無規卷曲(random coil)構成(圖4)，其中45.51%的氨基酸構成α-螺旋，41.85%的氨基酸構成無規卷曲，12.64%構成延伸鏈，因此藏綿羊基因編碼的蛋白可歸為混合類-蛋白質[23]。采用SWISS-MODEL軟件對藏綿羊編碼的蛋白質建模獲得部分三級結構模型(圖4)，從部分模型中可以看出，其三級結構中主要由α-螺旋、無規卷曲和延伸鏈構成，跟二級結構預測結果基本一致。

圖3 藏綿羊FAM134B基因CDS區的核苷酸和編碼蛋白的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequence and amino acid sequence in the CDS region of Tibetan sheep FAM134B gene

表2藏綿羊FAM134B基因編碼蛋白的氨基酸組成

Table2Composition of amino acid coded by Tibetan sheepFAM134Bgene

氨基酸Aminoacid數量Number頻率Frequency/%氨基酸Aminoacid數量Number頻率Frequency/%Ala(A)Arg(R)Asn(N)Asp(D)Cys(C)Gln(Q)Glu(E)Gly(G)His(H)Ile(I)Leu(L)21911298173224514455.902.533.098.152.254.788.996.741.403.9312.64Lys(K)Met(M)Phe(F)Pro(P)Ser(S)Thr(T)Trp(W)Tyr(Y)Val(V)Glx(Z)Asx(B)244181540203512006.741.125.064.2111.245.620.841.403.370.00.00

2.5藏綿羊FAM134B亞細胞定位以及功能預測分析

利用PSORT II Prediction軟件對FAM134B的亞細胞定位進行預測分析，結果表明，FAM134B編碼的蛋白在內質網、細胞質膜、空泡、細胞核、高爾基體、細胞骨架和線粒體中分別占30.4%、21.7%、17.4%、17.4%、4.3%、4.3%和4.3%。在內質網中分布最多，其次是細胞質膜。利用Protfun2.2軟件預測FAM134B功能分類，結果顯示，該蛋白在運輸與結合過程、電壓激活離子通道、嘌呤和嘧啶、信號轉導分子、離子通道、輔因子的生物合成、陽離子通道、轉錄因子和轉錄調控因子發揮功能的可能性分別為0.773、0.279、0.331、0.205、0.169、0.279、0.146、0.219和0.111(表3)，前三種明顯高于其他預測功能，由此可推測FAM134B基因編碼的蛋白在物質運輸與結合過程、輔因子的生物合成等過程中起到離子通道載體和信號轉導及轉錄調控等重要作用，尤其是協助蛋白質的組裝運輸等功能。

2.6藏綿羊FAM134B蛋白同源性及系統發育分析

利用MegAlign軟件對藏綿羊和其他物種的FAM134B核酸序列和氨基酸序列進行對比(表4)，結果表明，藏綿羊FAM134B氨基酸序列與普通綿羊完全一致，與山羊具有較高同源性，與人類最遠，說明藏綿羊FAM134B在哺乳動物之間具有高度保守性；根據藏綿羊和其他動物FAM134B 氨基酸序列，使用MegAlign 軟件，采用鄰近法構建分子進化樹。結果表明，藏綿羊與綿羊FAM134B 聚為一類，距離較近，與人進化關系較遠(圖5)。

2.7藏綿羊FAM134B基因在不同組織中mRNA表達分析

如圖6所示，FAM134B基因表達量從高到低依次是：網胃、回腸、盲腸、大腦枕葉、腦干、結腸、松果體、肝臟、直腸、脾臟、十二指腸。表明FAM134B基因在各個組織中的表達有差異，說明FAM134B的轉錄有一定的組織特異性，在網胃中最高，在脾臟和十二指腸中表達量最低，其他組織中表達量居中。

圖中黑色的線表示α-螺旋，深灰色的線表示延伸鏈，淺灰色的線代表無規則卷曲The black line represents α-helix， the dark grey line represents extended strand and the light grey line represents random coil圖4 FAM134B氨基酸序列二級結構、三級結構預測Fig.4 The predicted secondary structure and a part of putative tertiary structure of amino acid sequence of FAM134B

表3FAM134B功能分析結果

Table3Analysis of FAM134B function

功能分類Functionalcategory概率Probability基因本體分類Geneontologycategory概率Probability氨基酸生物合成(Aminoacidbiosynthesis)0.011信號轉導分子(Signaltransducer)0.205輔因子的生物合成(Biosynthesisofcofactors)0.210受體(Receptor)0.007細胞被膜(Cellenvelope)0.033轉運蛋白(Transporter)0.025細胞加工(Cellularprocesses)0.030離子通道(Ionchannel)0.169中央中間代謝(Centralintermediarymetabolism)0.048電壓激活離子通道(Voltage-gatedionchannel)0.279能量代謝(Energymetabolism)0.035陽離子通道(Cationchannel)0.146脂肪酸代謝(Fattyacidmetabolism)0.017轉錄因子(Transcription)0.219嘌呤和嘧啶(Purinesandpyrimidines)0.331轉錄調控因子(Transcriptionregulation)0.111監管職能(Regulatoryfunctions)0.034應激反應(Stressresponse)0.073復制和轉錄(Replicationandtranscription)0.020免疫反應(Immuneresponse)0.011翻譯(Translation)0.071生長因子(Growthfactor)0.005運輸和結合(Transportandbinding)0.773金屬離子轉運(Metaliontransport)0.018

表4藏綿羊和其他物種間FAM134B基因序列和氨基酸序列一致性比較

Table4Identities of nucleotide and amino acid sequences of FAM134B between Tibetan sheep and other species

物種SpeciesGenBank登錄號GenBankaccessionNo.核苷酸序列一致性Identityofnucleotidesequence/%氨基酸序列一致性Identityofaminoacidsequence/%綿羊OvisariesXM_004017080.198.6100.0普通牛BosTaurusNM_001015672.297.197.5牦牛BosgrunniensKM587693.197.297.2山羊CaprahircusKF684947.198.598.6黑猩猩PantroglodytesGABF01005134.188.092.5海象OdobenusrosmarusXM_004408337.288.388.5獼猴MacacamulattaNM_001261775.188.692.7人HomosapiensBC053326.162.690.8

圖5 FAM134B氨基酸序列系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of amino acid sequences of FAM134B

圖6 FAM134B基因在不同組織中的表達Fig.6 Relative expression of FAM134B mRNA in different tissues

3 討論

目前，國內外對FAM134B基因生理功能的研究相對較少，僅在人、小鼠、牦牛、黑山羊上有研究，綿羊FAM134B基因的核酸序列已有報道，但是在高原特色動物藏綿羊上沒有報道。本試驗采用RT-PCR獲得了藏綿羊FAM134B基因的CDS區核苷酸序列和氨基酸序列，并對藏綿羊FAM134B不同組織基因的相對表達量進行了研究。用生物信息學方法預測和分析FAM134B基因編碼產物，為更一步研究藏綿羊FAM134B基因的遺傳特性奠定了理論基礎。

蛋白質半衰期與其穩定性有關。賈浩等[24]的研究認為，一般來說，半衰期長則蛋白質穩定性高。本試驗表明，FAM134B基因編碼的蛋白具有較長的半衰期，但卻屬于不穩定蛋白。預測的FAM134B的二級結構是以無規卷曲和α-螺旋和延伸鏈為主，無規卷曲和α-螺旋各占一半，結構決定功能，推測這種結構可能會影響該蛋白在物質運輸或離子通道中以及信號轉導中的作用，具體功能有待后續試驗驗證。

藏綿羊FAM134B基因亞細胞定位和功能預測結果顯示，此蛋白在運輸與結合過程中發揮功能的可能性為77.3%，作為電壓激活離子通道離子通道、和陽離子通道發揮功能的可能性分別為27.9%、16.9%、14.6%，這個結果和曾國敏等[5]研究的牦牛FAM134B基因功能完全一致，推測可能與牦牛親緣關系較近有關，可推測此蛋白在物質運輸方面起主要作用。

物種間親緣關系的遠近用相似性或者同源性來反映。藏綿羊與綿羊、山羊核酸序列一致性分別為98.6%，98.5%；氨基酸序列達到100%，與山羊達到98.6%，與綿羊氨基酸序列同源性為100%。上述結果與綿羊的動物分類學和氨基酸序列的系統發育得到的觀點是一致的，說明藏綿羊FAM134B在生物進化中相對比較保守。

基因組織表達分析有助于研究轉錄活性[25]，在研究不同組織分子調控時，需要考慮的一個重要因素是mRNA表達[26]，藏綿羊FAM134B基因在各個組織中都有表達，說明FAM134B的轉錄有一定的組織特異性，這有可能與在不同組織中表達的功能相關。通過熒光定量PCR分析發現，藏綿羊FAM134B基因相對表達量從高到低依次是：網胃、回腸、盲腸、大腦枕葉、腦干、結腸、松果體、肝臟、直腸、脾臟、十二指腸。在網胃和回腸中表達量相對高于其他組織，在十二指腸和脾臟中表達量最低。網胃中表達量最高，而朱武政等[4]推測該基因可能與骨骼肌含量有關，肌肉中骨骼肌含量很高，肌肉組織是肌內脂肪沉積最重要的組織[27]，網胃結構包括胃壁肌肉故推測可能控制脂肪沉積，這與本試驗結果一致。大腦和小腸、肝臟表達量也很高，而脂質代謝主要在肝臟和小腸中進行，推測該基因也可能參與神經系統和脂質代謝的調控[28]。

由于FAM134B基因發現時間很短，故國內外有關該基因功能的報道很少。本試驗用多種生物信息學軟件對藏綿羊FAM134B編碼產物進行預測和分析，為揭示FAM134B基因結構和生理功能及遺傳特性奠定理論基礎。

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(責任編輯張 韻)

MolecularcloningandexpressionanalysisofFAM134BgeneinTibetansheep

LI Wenli1，2， DU Xiaohua2，3， LIU Xia1，2，*， GAO Jingbo1，2， SHEN Chaochao1，2， ZHANG Chao1，2， LIU Wei1，2

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China; 2.GansuKeyLaboratoryofHerbivorousAnimalBiotechnology，Lanzhou730070，China; 3.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The gene ofFAM134B(family with sequence similarity 134， member B) was cloned by RT-PCR. The bioinformatics analysis was carried out by using biological software. The expression level ofFAM134Bwas also studied by real-time fluorescence quantitative PCR. The full length ofFAM134Bgene was 1 144 bp (GenBank accession number: KX580309)， open reading frame 1 071 bp， encoding 356 amino acids. The phylogenetic tree showed that the Tibetan sheepFAM134Bhad a close relationship with the sheep and goat. The molecular formula of FAM134B protein in Tibetan sheep was C1717H2696N448O572S12， its molecular weight was 39151.72 u， the theory isoelectric point was 4.49， the extinction coefficient was 24 450. The instability index was 43， the aliphatic index was 80.31， and the grand average hydropathicity was -0.422. It was unstable and soluble acidic protein. The secondary structure of FAM134B was mainly composed of α-helices and random coil and extended chain， with α-helices was 45.51%， random coil was 41.85% and extension chains was 12.64%， which belongs to mixed type of protein. The results of subcellular localization and function showed that the frequencies of FAM134B protein in endoplasmic reticulum and cytoplasmic membrane were 30.4% and 21.7%. It mainly plays a role in protein transport and binding(77.3%). Phylogenetic tree showed that the amino acid sequence of FAM134B showed high homology with sheep and goat. qRT-PCR results showed that the expression ofFAM134Bgene was the highest in the stomach and lowest in the duodenum. The results can provide a theoretical basis for further study on the structure and physiological functions and genetic characteristics ofFAM134Bgene.

Tibetan sheep;FAM134Bgene; CDS cloning; bioinformatics; expression

S826

：A

：1004-1524(2017)09-1474-08

李文麗，杜曉華，劉霞，等. 藏綿羊FAM134B基因克隆與表達分析[J].浙江農業學報，2017，29(9)： 1474-1481.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.08

2016-12-26

農業部畜禽遺傳資源與種質創新重點實驗室開放課題資助(nzdsys2015-1)

李文麗(1991—)，女，甘肅會寧人，碩士研究生，從事生物化學與分子生物學研究工作。E-mail: 1406523498@qq.com

*通信作者，劉霞，E-mail：liux@gsau.edu.cn