微藻貼壁培養對沼液廢水的處理效果

程鵬飛，王 艷，楊期勇，劉德富，劉天中

(1.武漢大學 水利水電學院，湖北 武漢 430072； 2.九江學院 鄱陽湖生態經濟研究中心，江西 九江 332005； 3.九江學院 電子商務學院，江西九江 332005； 4.湖北工業大學 土木建筑與環境學院，湖北 武漢 430072； 5.中國科學院 青島生物能源與過程研究所，山東 青島 266101)

微藻貼壁培養對沼液廢水的處理效果

程鵬飛1，2，王 艷3，楊期勇2，劉德富4，*，劉天中5

(1.武漢大學 水利水電學院，湖北 武漢 430072； 2.九江學院 鄱陽湖生態經濟研究中心，江西 九江 332005； 3.九江學院 電子商務學院，江西九江 332005； 4.湖北工業大學 土木建筑與環境學院，湖北 武漢 430072； 5.中國科學院 青島生物能源與過程研究所，山東 青島 266101)

以產油藻類柵藻、小球藻為研究對象，通過貼壁方式考查微藻處理養豬沼液廢水的效果。結果表明，柵藻、小球藻均能在沼液中較好生長，其生物產率分別是6.26、6.08 g·m-2·d-1，與在正常培養基上(BG11)相當。柵藻、小球藻在沼液中培養，藻細胞油脂積累分別占細胞干重的34.6%和31.4%，與正常培養基相差不大。柵藻、小球藻均能較好凈化廢水中主要污染指標氨氮(NH3-N)、總磷(TP)及化學需氧量(COD)，柵藻的去除率分別是96.59%、74.52%和72.47%，小球藻去除率分別是94.90%、73.55%和71.40%。本研究將產油微藻培養和養豬沼液廢水處理相結合，研究結果可為藻類生物燃料生產及沼液廢水資源化利用等提供理論基礎。

微藻；貼壁培養；沼液

當前，生豬養殖廢水主要采用厭氧發酵產沼氣處理技術，該方法在廢水凈化效果與經濟效益方面均有一定優勢，但處理后的沼液仍含有豐富的氮、磷等大量元素及各種微量元素[1-2]，成分復雜，較難處理。傳統的“豬-沼-果”“豬-沼-魚”等沼液利用模式能夠有效提高土壤肥力，改善果蔬與魚苗的生長品質；但是這些沼液的規模化利用方式面臨消納土地不足及農戶不接受等問題，加大了養殖污水處理難度，造成資源的浪費和環境的污染[3-4]。因此，沼液廢水的處理迫切需要能夠資源化利用的集成技術。

豬糞沼液廢水中含有大量藻類生長所需的氮、磷以及其他營養物質，將養豬沼液廢水凈化與微藻的培養相結合，既可以達到排放標準，降低沼液處理成本，又可以節約微藻的培養成本，同時還可利用微藻生物質中的高附加值產物[5-6]。但是，傳統的液體懸浮培養(如跑道池等)處理沼液因占地面積大、處理效率不高、條件不易控制、采收成本較高等問題一直未能被大面積推廣應用。Chiu等[7]將小球藻(ChlorellavulgarisYSW-04)在傳統的光反應器(PBRs)中進行懸浮培養，以凈化沼液廢水，結果藻細胞生長受到抑制，生物產率較低，而且培養后的藻細胞需離心分離才能最終凈化水質，效果欠佳。

貼壁培養是一種依據光稀釋與固定化的原理，將藻細胞與培養基相分離，并固定在一定的生物膜材料上，極少量的培養基液體通過附著多孔材料的背面或內部滴入，使藻細胞處于半干濕潤狀態，并在一定光照強度與營養鹽濃度下進行生長的培養方式(圖1)[8]。利用貼壁方式培養微藻處理沼液廢水，因反應裝置的特殊性，培養結束后可省去藻細胞離心的高能耗過程，降低成本。在眾多微藻中，柵藻(Scendesmusdimorphus)、小球藻等在培養過程中可積累較多油脂，且對污水耐受能力強，是較為理想的凈化污水的藻種資源[9]。本研究擬采用貼壁方式培養柵藻、小球藻，考查藻細胞在沼液廢水中生長、油脂積累情況，及對NH3-N、TP、COD的去除效率，以期探索出一種利用柵藻、小球藻貼壁培養處理養豬沼液廢水的方法，為沼液污染控制及現代畜禽產業發展提供“綠色生態”途徑。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養基

試驗所用柵藻、小球藻藻種由湖北工業大學實驗室保藏。2種微藻液體種子培養過程所用培養基為BG11培養基[10]

1.2 沼液廢水

試驗前期，采集武漢地區多家養豬場沼液廢水，并進行指標測定，綜合沼液指標、廢水穩定性與連續性及場地的便利性等因素，選用武漢某畜禽企業某地區經厭氧發酵后的養豬沼液廢水作為處理對象。取水時間為2016-07-16 T 10∶00。廢水經自然沉降2 d后，取上清液，測定其初始氨氮(NH3-N)、總磷(TP)、化學需氧量(COD)分別為302.1、31.0、563 mg·L-1。

1.3 反應器與培養方法

試驗所用反應器為玻璃柱式反應器，內直徑0.05 m， 柱高0.55 m，反應體積0.9 L。反應器內部布置直徑5 mm的玻璃通氣管，混合有1.5% CO2(V/V)的壓縮空氣(0.1 MPa)通過通氣管從反應器底部曝氣，攪動藻液并補充碳源。前期研究顯示，光照強度100 μmol photons·m-2s-1下藻細胞生長較好。為了考查試驗條件下微藻生長的最高效率，2株藻類培養過程中均采用連續光照，培養柱表面光強100 μmol photons·m-2s-1，培養溫度(25±1)℃。

貼壁培養反應裝置如圖1所示，將長0.4 m、寬0.2 m、厚3 mm的玻璃板置于0.5 m×0.3 m×0.05 m的玻璃腔中，玻璃板的一面附有濾紙，并接受正上方的光照。將2株藻種分別接種于醋酸纖維素膜上，貼于附著在玻璃板的濾紙上，將附有藻種的玻璃板放入玻璃腔室內。為保障玻璃腔室內的環境穩定，用保鮮膜封住玻璃腔的一面，2 L培養基液體通過循環泵滴加(循環使用)。為了使培養液更均勻地滲入藻細胞內，將玻璃培養腔放置一定角度，熒光燈置于培養腔正上方提供光源。用沼液廢水進行貼壁培養時，不通CO2，以空氣鼓泡代替；用BG11培養基進行貼壁培養時，正常通CO2，其他培養條件相同。

圖1 微藻貼壁培養裝置示意圖Fig.1 Structure of the attached cultivation device for microalgae

1.4 分析方法

1.4.1 藻細胞生物量測定

將0.45 μm、直徑50 mm的醋酸纖維濾膜煮沸3次后，在105 ℃烘箱中烘至恒重(m1)，將待測藻樣用去離子水沖至燒杯中，并倒入抽濾裝置中抽至已稱重的濾膜上(面積10 cm2)，將附著藻的濾膜放入105 ℃烘箱中烘至恒重(m2)，用分析天平稱量可得藻樣生物量(m)(g·m-2)。

m=(m2-m1)×1 000。

(1)

1.4.2 藻細胞油脂含量測定

藻細胞總脂含量的測定采用改進的氯仿-甲醇法[11]。收集藻細胞，用一定量蒸餾水沖洗離心后冷凍干燥。稱取50 mg(重量W1)藻粉于研缽中，加入200 mg已烘干的石英砂，研碎后加入5 mL甲醇、2.5 mL氯仿，高速振蕩5 min。搖床培養12 h，離心，取上清7.5 mL至新管1。向固相中再加入5 mL甲醇、2.5 mL氯仿，高速振蕩5 min，搖床培養2 h，離心，取上清7.5 mL至新管1，加入5 mL氯仿和9 mL質量濃度1%的NaCl，保證最終體系為甲醇∶氯仿∶1% NaCl=2∶2∶1.8(體積比)，振蕩混勻。將新管1于8 000 r·min-1離心10 min，去上清，下層液轉移入20 mL干凈玻璃管(已稱重W2)。61 ℃水浴下氮吹，氯仿被吹干后，于105 ℃烘3 h，冷卻后，稱重(W3)。

總脂含量(%)=(W3-W2)/W1×100。

(2)

1.4.3 NH3-N、TP及COD測定

取貼壁培養循環裝置中沼液廢水，每2 d取樣1次，分別測定NH3-N、TP及COD。氨氮采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009)測定；總磷采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893—89)測定；COD采用重鉻酸鉀氧化處理法(GB 11914—89)測定。

1.5 數據分析

試驗數據采用SPSS 10.0進行單因素方差分析 (one-way ANOVA)，對有顯著(P<0.05)差異的處理采用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 對柵藻、小球藻生長的影響

將對數期柵藻、小球藻種子液接種于貼壁反應器中，每2 d取樣1次，培養8 d后考查柵藻、小球藻在沼液廢水中的生長情況，并與BG11培養基條件下(正常培養)的生長情況進行比較(圖2)。柵藻在養豬沼液廢水原水中能較好生長，尤其在培養前2 d，生長較快，生物量明顯高于正常培養。培養8 d后，沼液廢水中柵藻生物量與正常培養無明顯差異。小球藻在沼液廢水中的生物產率為6.08 g·m-2·d-1，高于正常培養下的生物產率(5.45 g·m-2·d-1)。

2.2 對柵藻、小球藻貼壁培養油脂積累的影響

將柵藻、小球藻分別在沼液廢水和BG11培養基條件下貼壁培養，收集培養8 d后的藻細胞，分別考查油脂積累情況(圖3)。沼液廢水條件下柵藻的油脂含量略低于BG11培養基條件下，分別是34.6%、35.2%。由于柵藻細胞在2種培養條件下生物產率相近，因而其油脂產率也相近，分別為2.17和2.19 g·m-2·d-1。小球藻在沼液廢水條件下的油脂含量為31.4%，高于其在BG11培養基條件下的含量(29.6%)。相應地，小球藻貼壁培養在沼液廢水和BG11培養基條件下的油脂產率分別是1.91和1.69 g·m-2·d-1。

圖2 沼液廢水與正常培養基柵藻、小球藻貼壁生長狀況Fig.2 Growth of Scendesmus dimorphus and Chlorella pyrenoidosa with attached culture in swine wastewater and BG11 medium

圖3 沼液廢水與BG11培養基條件下柵藻(A)與小球藻(B)貼壁培養油脂積累情況Fig.3 Lipid accumulation of Scendesmus dimorphus (A) and Chlorella pyrenoidosa(B) with attached culture in swine wastewater and BG11 medium

2.3對沼液廢水中NH3-N、TP及COD的去除情況

由圖4可知，柵藻貼壁培養條件下，廢水中NH3-N濃度在最初2 d內下降較快，培養8 d后，由最初的302.1 mg·L-1降至10.3 mg·L-1；廢水中總P濃度在前4 d下降最快，培養8 d后，由初始濃度31.0 mg·L-1降至7.9 mg·L-1；培養8 d后，廢水中COD由初始563 mg·L-1降至155 mg·L-1。柵藻貼壁培養處理養豬沼液廢水8 d，廢水中NH3-N、TP及COD去除率分別是96.59%、74.52%和72.47%。

圖4 貼壁培養柵藻對NH3-N、TP及COD的去除情況Fig.4 Removal of NH3-N， TP and COD of wastewater with biofilm attached cultivation of Scendesmus dimorphus

由圖5可知，小球藻貼壁培養沼液中NH3-N濃度由最初的302.1 mg·L-1降到15.4 mg·L-1，總P濃度由起始的31.0 mg·L-1降至8.2 mg·L-1，COD濃度由563 mg·L-1下降至161 mg·L-1。小球藻貼壁培養對NH3-N、TP及COD的去除率分別是94.90%、73.55%和71.40%。

3 結論與討論

圖5 貼壁培養小球藻對NH3-N、TP及COD的去除情況Fig.5 Removal of NH3-N， TP and COD of wastewater with biofilm attached cultivation of Chlorella pyrenoidosa

微藻因其獨特的組成及結構而成為獲得生物柴油和生物質油的優良原料來源。相比其他動植物，利用藻類生產油脂生物燃料，增值迅速，含油量高，占地面積小，更具發展潛力。但如何降低微藻油脂燃料的生產成本仍然是國內外商業化開發面臨的主要問題。本研究表明，柵藻、小球藻在沼液廢水中貼壁培養產生的油脂含量與在BG11培養基上培養的相差不大，沼液廢水是柵藻、小球藻貼壁培養較好的替代介質。利用產油微藻貼壁培養處理養豬沼液廢水并耦合油脂生產，既可以降低培養成本，又能提高藻類生物燃料工業化生產的經濟性。

總體來看，本研究表明產油微藻——柵藻、小球藻貼壁培養處理沼液廢水具有可行性。將微藻應用于養豬沼液廢水處理，同時可生產油脂生物燃料，不僅能有效地降低水體富營養化水平，而且具有低成本、低能耗、低污染、高效率、高收益和高溶氧量等優勢，可以創造更多的經濟效益和生態效益。研究結果可為實現藻類生物燃料生產與廢水處理系統從“處理工藝”向“生產工藝”的轉化奠定基礎。

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(責任編輯高 峻)

Purificationeffectforswinewastewaterwithattachedcultureofmicroalgae

CHENG Pengfei1，2， WANG Yan3， YANG Qiyong2， LIU Defu4，*， LIU Tianzhong5

(1.SchoolofWaterResourcesandHydropowerEngineering，WuhanUniversity，Wuhan430072，China; 2.PoyangLakeEco-EconomyResearchCenterofJiujiangUniversity，Jiujiang332005，China; 3.E-BusinessInstituteofJiujiangUniversity，Jiujiang332005，China; 4.SchoolofArchitecturalandEnvironment，HubeiUniversityofTechnology，Wuhan430072，China; 5.QingdaoInstituteofBioenergyandBioprocessTechnology，ChineseAcademyofSciences，Qingdao266101，China)

The purification effect of swine wastewater treated byScendesmusdimorphusandChlorellapyrenoidosawith attached culture was investigated in this study. It was shown that the 2 strains could grow well in swine wastewater and the biomass ofScendesmusdimorphusandChlorellapyrenoidosareached 6.26 and 6.08 g·m-2·d-1， respectively. Meanwhile， the lipid content in the 2 strains was 34.6% and 31.4%， respectively， which was comparable with those cultivated in BG11 medium. Notably， attached culture ofScendesmusdimorphusandChlorellapyrenoidosacould treat swine wastewater efficiently. The removal efficiency of ammonia nitrogen (NH3-N)， total phosphorus (TP) and COD was 96.59%， 74.52% and 72.47%， respectively， byScendesmusdimorphusand 94.90%， 73.55% and 71.40%， respectively， byChlorellapyrenoidosa. Based on the results， a process combining algae-based wastewater treatment with attached cultivation and biodiesel production was proposed to treat swine wastewater.

microalgae; attached culture; swine wastewater

X703

：A

：1004-1524(2017)09-1564-06

程鵬飛，王艷，楊期勇，等. 微藻貼壁培養對沼液廢水的處理效果[J]. 浙江農業學報，2017，29(9)： 1564-1569.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.20

2017-02-06

國家自然科學基金項目(31560724)；中國博士后科學基金資助項目(2016M600616)

程鵬飛(1984—)，男，江西婺源人，博士，副教授，主要研究方向為環境生物技術。E-mail: 511944088@qq.com

*通信作者，劉德富，E-mail: dfliu@189.cn