液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中12種水溶性維生素

耿健強(qiáng)，趙麗，潘紅艷，邵明媛，王浩

（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京100094）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中12種水溶性維生素

耿健強(qiáng)，趙麗，潘紅艷，邵明媛，王浩

（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京100094）

建立了同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中多種維生素、牛磺酸等12種水溶性維生素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定法。采用MGⅢ-C18色譜柱，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相（梯度洗脫），流速為0.25 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量5 μL。方法檢出限0.0001～1 mg/kg，高、中、低不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)加標(biāo)回收率85.0%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～9.1%。該法具有樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單,靈敏度高,分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),適用于嬰幼兒配方奶粉中上述12種水溶性維生素的同時(shí)測(cè)定。

高效液相色譜儀；嬰幼兒配方奶粉；水溶性維生素

0 引 言

水溶性維生素是嬰兒配方奶粉的重要組成部分，在人體生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前我國(guó)國(guó)標(biāo)只能對(duì)單一或兩三種水溶性維生素進(jìn)行檢測(cè)，其中，牛磺酸、VB1、VB2、VB3、VB6主要用高效液相測(cè)定；VB5、VB9、VH和VB12主要用微生物法測(cè)定。這些方法前處理繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本高，不能滿足多種物質(zhì)快速同時(shí)檢測(cè)的要求。本文采用液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)對(duì)嬰幼兒配方乳粉中12種水溶性維生素測(cè)定，定量采用了作者獨(dú)創(chuàng)的測(cè)定液標(biāo)準(zhǔn)溶液加入定量法，克服了液質(zhì)法定量中經(jīng)常存在的基質(zhì)效應(yīng)，該方法準(zhǔn)確、靈敏，適用于大批量樣品的快速檢測(cè)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 6410型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，配Agi?lent1200型液相色譜儀，KQ-5200型超聲波清洗儀，Milli-Q去離子水發(fā)生器。

1.2 試劑與材料

甲醇，乙腈，鹽酸，氫氧化鈉，氨水，以上均為分析純。

VB1，VB2，VB3，VB5，VB6，VB9(葉酸)，VB12，VH，牛磺酸。

樣品購(gòu)自本地超市。

1.3 方法

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別稱取適量的煙酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別用超純水配成2.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取適量的泛酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水配成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取適量的維生素B1(硫胺素)標(biāo)準(zhǔn)品用濃度為0.01 mol/L鹽酸溶液溶解后，用超純水配成質(zhì)量濃度為0.5 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取適量的VB2(核黃素)標(biāo)準(zhǔn)品，用濃度為2 mol/L鹽酸溶液溶解后，用超純水配成質(zhì)量濃度為0.5 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取適量的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用適量水潤(rùn)濕，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%氨水溶液至完全溶解后，用超純水配成質(zhì)量濃度為0.1 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別稱取適量的吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺，VB12和生物素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用超純水配成質(zhì)量濃度為1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取適量的牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水配成質(zhì)量濃度為10.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別吸取上述適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成煙酸、煙酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、VB9(葉酸)、VB12(氰鈷胺)、VH（生物素）、牛磺酸質(zhì)量濃度為 250，250，200，25，50，25，25，25，5，0.25，1.5，1 500 g/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

1.4 色譜條件

色譜柱：資生堂 MGⅢ-C18柱，5 μm，2.0 mm×150 mm。

條件：流速0.25 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5μL，流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）+甲醇（B）。 梯度洗脫：0～5 min,B 由5%線性遞增至95%，5～10 min，B保持95%，10.0～10.1 min，B由95%線性遞減至5%，10.1～15.0 min，B保持5%。

1.5 質(zhì)譜分析條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子模式（牛磺酸為負(fù)離子模式）；檢測(cè)方式為多反應(yīng)檢測(cè)；干燥氣為N2；霧化氣壓力為275.8 kPa；干燥氣流速為8 L/min；汽化溫度為340℃；其質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間如表1所示。

表1 質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間

1.6 樣品處理

準(zhǔn)確稱取5 g樣品，用25.0 mL（50℃）熱水溶解，超聲10 min，用濃度為5 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至1.7，放置2 min后，再用濃度為2.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值至4.5。將樣品溶液移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度后，倒入漏斗用快速定性濾紙自然過(guò)濾，棄去最初濾液，在50 mL錐形瓶中收集濾液，并充分混勻，濾液過(guò)0.22 m有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.7 定性定量方法

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間及定性定量離子對(duì)比例對(duì)樣品峰進(jìn)行準(zhǔn)確定性；因?yàn)槟谭蹣悠坊|(zhì)復(fù)雜，如果用純標(biāo)定量，基質(zhì)效應(yīng)較大，所以本方法根據(jù)樣品的標(biāo)示值，在1.5 mL進(jìn)樣瓶中用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)測(cè)定液依次配制不同濃度的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)比較測(cè)定液和加標(biāo)溶液目標(biāo)化合物的差值，計(jì)算出測(cè)定液中12種水溶性維生素的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件選擇

水溶性維生素易溶于水，不溶于脂肪和有機(jī)溶劑，易分解。根據(jù)這12種水溶性維生素的化學(xué)特性，本研究先采用50℃熱水充分溶解乳粉，超聲提取10 min，為了充分破壞樣品中的蛋白質(zhì)，再加入酸溶液調(diào)節(jié)pH值至1.7，放置2 min后，再用2.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值至4.5。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，這種前處理的方法簡(jiǎn)便快速，加標(biāo)回收率高（平均加標(biāo)回收率＞85%），可以滿足方法學(xué)檢測(cè)要求。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇：為了有利于色譜峰的分離及鋒形的改善，本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150 mm × 2.0 mm,5 μm)、ZORBAX Eclipse XDB-C1 8色譜柱和ZORBAX SB-Aq色譜柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm）進(jìn)行分離試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)資生堂MGⅢ-C18色譜柱(150 mm × 2.0 mm,5 μm)效果較好。

流動(dòng)相的選擇：煙酸、煙酰胺、牛磺酸、VB1、VB6（包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺）屬于強(qiáng)極性化合物，在反相C8柱上保留較弱，而泛酸、葉酸、VB12、生物素為中等極性化合物，為了有利于色譜峰的分離及峰形的改善，本方法采用0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相，利用梯度洗脫的方法提高分離效果，測(cè)試開(kāi)始時(shí)，流動(dòng)相中0.1%甲酸水溶液-甲醇的比例為95∶5，然后在0～5 min改變二者的比例為5∶95，這一部分主要是洗脫測(cè)定液中煙酸等極性較強(qiáng)的目標(biāo)化合物，5～10 min內(nèi)保持此比例，這一部分主要是洗脫測(cè)定液中的中這一部分主要是洗脫測(cè)定液中泛酸等中等極性目標(biāo)化合物。通過(guò)上述兩步梯度，在10 min內(nèi)，可以較好的分離測(cè)定液中12種水溶性維生素（煙酸、煙酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、葉酸、VB12、生物素、牛磺酸）（結(jié)果如表1所示）。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式分別將質(zhì)量濃度為1 μg/mL的12種水溶性維生素（煙酸、煙酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、葉酸、VB12、生物素、牛磺酸）分別注入離子源中，在正離子（牛磺酸為負(fù)離子）檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子全掃描，得到12種水溶性維生素的分子離子峰。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令規(guī)定對(duì)于質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4個(gè)確證點(diǎn)的要求,低分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇兩個(gè)以上的子離子。分別以該離子峰為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，然后再對(duì)得到的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度比例達(dá)到最大時(shí)為最佳。最終得到12種水溶性維生素的最佳質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果如表1所示。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

將樣品加標(biāo)溶液分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)定結(jié)果經(jīng)線性回歸。線性范圍：煙酸、煙酰胺為 0.2 ～10.0 μg/mL, 泛酸為 0.1～7.5 μg/mL，維生素B1為0.1～1.0 μg/mL；維生素B2為0.1～2.0 μg/mL、吡醛醛、吡哆醇、吡哆胺為0.05～1 μg/mL；葉酸為0.1～10 ng/mL；維生素B12為0.1～10.0 ng/mL；生物素為5～50 ng/mL；牛磺酸為1～50 μg/mL。回歸方程（y為峰面積；x為質(zhì)量濃度，μg/mL）相關(guān)系數(shù)和檢出限如表2所示。

2.5 方法的回收率和精密度

稱取已知含量的同一樣品6份,每份5.00 g,分別添加三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,按供試品制備方法處理后,進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表3所示。從表中可看出,樣品加標(biāo)回收率85.0%～95.5%,平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～9.1%（n=6）。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

表2 12種水溶性維生素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

運(yùn)用本方法對(duì)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的5種品牌的嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。維生素實(shí)際測(cè)定含量與標(biāo)示值相符，均符合我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 10765-2010《嬰幼兒配方食品》和GB 10767-2010《較大嬰幼兒配方食品》。

表3 樣品中12種水溶性維生素的的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

（續(xù)表3）

3 結(jié) 論

本文建立了液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中煙酸、煙酰胺、泛酸、VB1、VB2、吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺、葉酸、VB12、生物素、牛磺酸的快速定性定量方法。該法分析時(shí)間小于10 min，其線性關(guān)系良好（r＞0.999）,檢出限在 0.0001～1 mg/kg之間。在3個(gè)水平添加回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6次，其平均回收率在85.0%～95.5%之間，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。該方法快速準(zhǔn)確，可靠，并且靈敏度高，有望應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素含量的同步定性定量測(cè)定。

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表4 檢測(cè)結(jié)果 μg/100g

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Study on simultaneous detection of 12 Water-soluble Vitamins in infant milk powder by HPLC-MS

GENG Jianqiang,ZHAO Li,PAN Hongyan,SHAO Mingyuan,WANG Hao

(Nation Food Quality&Safety Supervision and Inspection Center,Beijing 100094，China)

This thesis developed a method for simultaneous determination of 12 Water-soluble Vitamins in infant milk powder by HPLC-MS.The chromatography was performed using a MGⅢ-C18 column(150 mm × 2.0 mm,5 μm),with a mobile phase consisting of 0.1%formic acid–methanol solution by gradient elution,the flow was 0.25 mL/min,the column temperature was 25℃,and the injection volume was 5 μL.The limits of quantitation were between 0.0001 mg/kg and 1 mg/kg.Overall recoveries of high,medium and low concen?trations were between 85.0%and 95.5%,and RSD(n=6)value were between 2.9%and 9.1%.The results showed that the method was sensi?tive,accurate,convenient and quick,which can be used to detect simultaneously the 12 water-soluble Vitamins in infant milk powder.

HPLC-MS；infant milk powder；Water-soluble Vitamins

TS252.7

A

1001-2230（2017）08-0043-04

2017-02-17

耿健強(qiáng)（1977-），男，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称钒踩O(jiān)管。

趙麗