乳制品中三聚氰胺的免疫親和凝膠柱檢測方法

齊玉杰，生威，王俊平，張燕，王碩

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457)

乳制品中三聚氰胺的免疫親和凝膠柱檢測方法

齊玉杰，生威，王俊平，張燕，王碩

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457)

為建立用于檢測乳制品中三聚氰胺的免疫親和凝膠柱檢測方法，本研究采用活化酯法制備三聚氰胺酶標抗原，將三聚氰胺抗體、HRP抗體分別與溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯制備相應的抗體膠作為檢測層和質控層，方法檢測限為200 μg/L。選取牛奶、奶粉、發酵乳等乳制品進行檢測，測得所檢樣品中三聚氰胺的檢測限為1 mg/kg。該方法具有良好的特異性，除與環丙氨嗪存在一定的交叉反應外，與其他3種結構類似物和6種常用獸藥沒有交叉反應。該檢測方法操作簡便，結果判斷容易，整個檢測過程約15 min，可用作三聚氰胺現場快速檢測的有效手段。

免疫親和凝膠檢測柱；三聚氰胺；乳制品

0 引 言

三聚氰胺[1]，俗稱密胺、蛋白精，是一類重要的有機化工原料，在木材、塑料、造紙、紡織、皮革等行業有廣泛的應用。由于其價格低廉被一些不法企業違規使用到食品中，以達到檢測中蛋白質含量達標或超標的假象，導致人們食用后出現若干不良反應，嚴重時甚至危及生命。2011年我國衛生部聯合5個部門發布第10號公告，明確規定各類乳制品中三聚氰胺的限量值，凡是高于此標準的食品一概嚴禁銷售[2]。目前，檢測食品中三聚氰胺的方法有HPLC[3-5]、LC-MS/MS[6-8]、GC-MS[9]、拉曼光譜法[10-11]、ELISA[12]、膠體金免疫層析法[13-15]等。本研究建立的檢測食品中三聚氰胺的免疫親和凝膠檢測柱方法，具有操作簡單、檢測快速、結果可視化、定性半定量的特點，適用于大量樣品中三聚氰胺的現場初步篩查。

1 實驗

1.1 儀器設備

超純水系統，蛋白純化儀，紫外分光光度計，磁力攪拌器，周轉式振搖器，旋渦混合器，冷凍離心機，真空泵，具砂板層析柱，無填料SPE小柱（1 mL），聚乙烯墊片。

1.2 藥品

三聚氰胺，環丙氨嗪，三聚氰酸，阿特拉津，呋喃它酮，諾氟沙星，磺胺喹惡啉，氯霉素，慶大霉素，四環素，辣根過氧化物酶（HRP），溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，HRP抗體，三聚氰胺抗體。

1.3 常用溶液的配制

（1）偶聯緩沖液。準確稱取7.3 g NaCl，2.1 g NaHCO3，加入250 mL超純水，用NaOH調pH至8.3。

（2）封閉液。稱取0.6 g甘氨酸，加入20 mL偶聯緩沖液溶解，放置4℃保存備用。

（3）醋酸緩沖液。準確稱取5.84 g NaCl，0.9 g CH3COONa，1.16 mL CH3COOH，加入200 mL超純水。

（4）溶脹酸液（濃度1 mmol/L的HCL）。量取0.5 mL濃度為1 mol/L鹽酸，加入500 mL超純水。

（5）底物顯色液（TMB-過氧化氫脲溶液）。

底物液A：稱取無水醋酸鈉4.1 g，β-環糊精1.25 g，檸檬酸1.58 g，過氧化氫脲214.5 mg，加超純水至500 mL，4℃保存，使用時需要事先恢復至室溫。

底物液B：稱取100 mg TMB，加入10 mL DMSO溶解，室溫避光保存。

使用前15 min混合：12.43 mL A溶液和0.075 mL B溶液。

（6）磷酸鹽緩沖溶液（PBS，濃度0.05 mol/L，pH 7.4）。 稱 取 Na2HPO4·12H2O 13.76 g，NaH2PO4·2H2O 1.794 g，NaCl 9.0 g，溶于1 000 mL超純水。

1.4 方法

1.4.1 酶標抗原（MEL-HRP）的制備

三聚氰胺半抗原由本實驗室提供，采用活化酯法與HRP偶聯制備酶標抗原。具體操作：稱取三聚氰胺半抗原1.0 mg置于棕色瓶中，加入1.0 mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），之后加入100 μL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）使其溶解，再加入1.4 mg N,N-二環已基碳二亞胺（DCC），置于4℃條件下攪拌反應20 h，這個過程中會出現渾濁，反應結束后于4℃，4 500 r/min離心10 min，取上清液。取5.0 mg的HRP加入到2.0 mL的PBS緩沖溶液（濃度0.01 mol/L，pH=8.5）溶解，此為HRP蛋白溶液。然后將上清液在冰浴條件下逐滴緩慢加入到HRP蛋白溶液中，攪拌過夜。結束后取出反應液用PBS緩沖溶液4℃透析3 d，收集透析后溶液加等體積甘油，保存備用。

1.4.2 免疫親和凝膠檢測柱的制備

（1）封閉膠的制備。稱取1.0 g溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，加入80 mL濃度為1 mmol/L的HCl溶液于小燒杯中，用玻璃棒充分攪拌溶解。先用約10 mL HCl溶液對具砂板層析柱進行清洗，將溶脹充分的凝膠轉移其中，繼續用大概200 mL HCl溶液清洗凝膠，然后用約30 mL偶聯緩沖液沖洗凝膠。再加入9 mL甘氨酸封閉液，室溫下在定向搖床上振搖反應2 h，反應完后依次用偶聯緩沖液、醋酸緩沖液清洗3次，每次10 mL，最后再用偶聯緩沖液清洗一次。最后抽空，用約10 mL的PBS緩沖溶液將制備好的封閉膠重新懸起，加入3 μL的proclin 300抑菌素，置于4℃保存備用。

（2）三聚氰胺抗體膠的制備。將三聚氰胺抗體與溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯制備抗體膠用作檢測層。具體步驟為稱取0.25 g溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，加入40 mL濃度為1 mmol/L的HCl溶液于小燒杯中，用玻璃棒充分攪拌溶解。先用約10 mL的HCl溶液對具砂板層析柱進行清洗，將溶脹充分的凝膠轉移其中，繼續用大概200 mL的HCl溶液清洗凝膠，然后用約30 mL偶聯緩沖液沖洗凝膠。取0.5 mg三聚氰胺抗體，加入1～2 mL偶聯緩沖液進行稀釋，混合均勻后轉移到柱子中，并于室溫振搖反應2 h。然后用10～20 mL偶聯緩沖液清洗凝膠，以去除多余的抗體。再加入3.5 mL甘氨酸封閉液，室溫下在定向搖床上振搖反應2 h。應完后依次用偶聯緩沖液、醋酸緩沖液清洗3次，每次10 mL，最后再用偶聯緩沖液清洗一次。最后抽空，用約5 mL PBS緩沖溶液將制備好的抗體膠重新懸起，加入1.5 μL proclin 300抑菌素，置于4℃保存備用。

（3）HRP抗體膠的制備。將HRP多克隆抗體與溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯制備HRP抗體膠用作質控層。制備步驟同1.4.2.2三聚氰胺抗體膠的制備。

1.4.3 免疫親和凝膠檢測柱分析方法的建立

（1）三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱的組裝及檢測步驟。免疫親和凝膠檢測柱由上下兩部分組成，檢測層在上，質控層在下，兩層之間有一個約2 mm的空氣隔層。將150 μL封閉膠按一定比例混合的HRP抗體膠由SPE小柱上部加入到底部的聚乙烯墊片上，用注射器瀝干緩沖液，加入第二個墊片，力度以緊密接觸凝膠且又不對其造成擠壓為宜。在距離下層墊片約2 mm處放置第三個聚乙烯墊片，將150 μL封閉膠按一定比例混合的三聚氰胺抗體膠加入到聚乙烯墊片上，用注射器瀝干緩沖液，最后固定第四個聚乙烯墊片，完成檢測柱的組裝。

檢測步驟：按上述方法組裝好檢測柱，用PBS緩沖溶液清洗兩次，每次清洗體積為1 mL。將PBS緩沖溶液按一定比例稀釋酶標抗原與標準品或樣品溶液，取1 mL混合溶液以1 mL/min的流速通過檢測柱。然后用3 mL的PBST緩沖溶液和2 mL PBS緩沖溶液清洗檢測柱，目的是除去干擾實驗的殘留物。最后取300 μL底物溶液加入到檢測柱中，與檢測層和質控層充分反應30 s后推出，觀察4 min內檢測柱上下層的顯色情況。

（2）三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱工作條件的優化

①酶標抗原最低稀釋比例的確定。從SPE柱的進樣口加入150 μ L封閉膠到底部的聚乙烯墊片上，用注射器把緩沖液打出后放入第二個聚乙烯墊片。用PBS緩沖溶液對酶標抗原進行稀釋，稀釋比例分別為 1∶1 000，1∶5 000，1∶10 000，1∶50 000，1∶10 0000，1∶50 0000，取1 mL酶標抗原溶液加入到檢測柱中，用注射器在1 min內勻速排出，最后加入底物反應30 s后排出，觀察4 min內凝膠層的顏色變化，當封閉膠無色時，說明沒有非特異性吸附，此時酶標抗原的稀釋比例為其最低稀釋比例。

②抗體膠及酶標抗原最佳稀釋比例的優化。將三聚氰胺抗體膠和封閉膠分別按不同比例1∶4，1∶9，1∶19(體積比)進行混合，酶標抗原選取最低稀釋比例以上的幾組數據，兩者任意組合進行優化，按檢測步驟操作，觀察4 min內檢測層的顏色變化，當檢測層的藍色清晰且梯度明顯時，此時三聚氰胺抗體膠和酶標抗原的稀釋比例分別為其最佳稀釋比例。

③HRP抗體膠最佳稀釋比例的優化。在上述已確定的條件基礎上，將HRP抗體膠與封閉膠分別按不同比例1∶9，1∶49，1∶99，1∶149，1∶199(體積比)進行混合，同上述檢測步驟，選擇與檢測層顯色一致時，HRP抗體膠稀釋比例為質控層的最佳稀釋比例。

④樣品稀釋液的優化。按優化好的條件組裝檢測柱，分別用不同pH值（5.7，7.4，8.5）的PBS和PBST緩沖溶液稀釋三聚氰胺標準品，經檢測柱分析，探究不同稀釋液對顯色情況及檢測限的影響，進而選擇出最佳的樣品稀釋液。

（3）免疫親和凝膠檢測柱檢測限的確定。選擇上述已優化確定的工作條件按要求組裝檢測柱，建立三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱分析方法，分別檢測不同濃度的三聚氰胺標準品溶液，以目測檢測層顏色消失時，對應的三聚氰胺的最低濃度定義為三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱分析方法的檢測限。

（4）免疫親和凝膠檢測柱特異性實驗。本實驗選取環丙氨嗪、三聚氰酸、阿特拉津、三聚氯氰4種結構類似物，以及呋喃它酮、諾氟沙星、磺胺喹惡啉、氯霉素、慶大霉素、四環素6種其他種類的獸藥進行特異性實驗。

（5）免疫親和凝膠檢測柱實際樣品的檢測。

本實驗選取牛奶、發酵乳和奶粉等乳制品進行檢測，牛奶不需要經過復雜的前處理，稀釋5倍即可直接用于檢測。發酵乳采用稀釋和離心的方法，具體步驟為取1 mL發酵乳，加入2 mL樣品稀釋液，高速漩渦混勻，10 000 r/min，4℃，離心10min，取上清液稀釋2.5倍后用于檢測。奶粉的具體處理步驟為稱取1 g奶粉，加入2.5 mL樣品稀釋液，高速漩渦混勻，10 000 r/min，4℃，離心10 min，取上清液稀釋2倍進行檢測。

2 結果和討論

2.1 工作條件的優化

2.1.1 三聚氰胺抗體膠和酶標抗原稀釋比例的優化

為消除封閉膠的影響需要對酶標抗原的稀釋比例進行優化，實驗發現，當酶標抗原的稀釋比例為1∶5 000，凝膠層不顯示藍色，表明此稀釋比例下，酶標抗原與封閉膠之間沒有發生非特異吸附反應，因而確定酶標抗原的最低稀釋比例為1∶5 000，在此基礎上對三聚氰胺抗體膠和酶標抗原的稀釋比例繼續進行優化，結果如表1所示了。由表1可以看出，隨著酶標抗原和抗體膠稀釋比例的增大，檢測層顏色也逐漸變淺。當三聚氰胺抗體膠與封閉膠的混合比例為1∶4，酶標抗原的稀釋比例為1∶10 000以及三聚氰胺抗體膠與封閉膠的混合比例為1∶9，酶標抗原的稀釋比例為1∶5 000時，檢測層顯色適當便于觀察，且前者較后者梯度更加明顯，檢測限更低。綜合考慮顯色情況、方法靈敏度，最終選擇三聚氰胺抗體膠與封閉膠的混合比例為1∶4，酶標抗原的稀釋比例為1∶10 000。

表1 三聚氰胺抗體膠和酶標抗原稀釋比例的優化結果

2.1.2 HRP抗體膠最佳稀釋比例的優化

在三聚氰胺抗體膠與酶標抗原的稀釋比例確定的基礎上后，按照空白對照，質控層與檢測層顏色保持一致的原則，優化質控層HRP抗體膠的稀釋比例。結果顯示，當HRP抗體膠與封閉膠的混合比例為1∶149時，符合實驗要求。圖1為質控層和檢測層的優化結果。

圖1 質控層和檢測層優化結果

2.1.3 樣品稀釋液的優化

本研究分別選擇pH值為5.7，7.4，8.5的PBS緩沖溶液和PBST緩沖溶液稀釋三聚氰胺標準品，質量濃度為0和200 μg/L，以最優工作條件組裝檢測柱進行檢測，結果如圖2和圖3所示。實驗發現，當選擇pH值為5.7的PBST緩沖溶液時，此時檢測柱上下層顏色適中便于觀察，且三聚氰胺質量濃度為200 μg/L，檢測柱上層消色。而當選擇pH值為5.7和7.4的PBS緩沖溶液和pH值為7.4的PBST緩沖溶液，且當三聚氰胺質量濃度為200 μg/L時，檢測柱上層有輕微藍色，沒有完全消線。選擇pH值為8.5的PBS緩沖溶液和PBST緩沖溶液時，檢測柱整體顏色較淺，且三聚氰胺濃度為200 μg/L時，檢測柱上層藍色沒有完全消失。因而選擇pH值5.7的PBST溶液作為三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱的最佳樣品稀釋液。

圖2 不同pH值的PBS優化結果

圖3 不同pH值的PBST優化結果

2.2 三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱檢測限的確定

以最優工作條件組裝檢測柱，依次加入三聚氰胺質量濃度為0，50，100，200 μg/L；可以看出，當三聚氰胺質量濃度為200 μg/L時，檢測層上層的藍色完全消失，因此確定三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱的檢測限為200 μg/L（圖4）。從左至右依次為0 μg/L 50 μg/L 100 μg/L 200 μg/L

圖4 三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱方法檢測限

2.3 三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱特異性實驗

本研究選擇4種三聚氰胺結構類似物，分別為環丙氨嗪、三聚氰酸、阿特拉津、三聚氯氰，以及6種其他種類獸藥，分別為呋喃它酮、諾氟沙星、磺胺喹惡啉、氯霉素、慶大霉素、四環素進行交叉反應實驗，其中三聚氰胺與環丙氨嗪的質量濃度為200 μg/L，其他物質的質量濃度均為20 mg/L。由圖6可以看出，除與環丙氨嗪存在一定的交叉反應外，與其他藥物均沒有交叉反應，表明本實驗所研制的檢測柱具有良好的特異性。

圖5 與結構類似物和其他種類獸藥的交叉反應

2.4 三聚氰胺免疫親和凝膠檢測柱實際樣品的檢測

本研究選取牛奶、發酵乳、奶粉等乳制品作為檢測樣品，按1.4.3.5對樣品進行前處理，實驗確定待測樣品經5倍稀釋即可消除基質影響，依次加入三聚氰胺濃度為0 mg/kg、1 mg/kg，由圖7可以看出，當三聚氰胺濃度為1 mg/kg時，檢測柱上層的顏色完全消失，因此確定乳制品中三聚氰胺的檢測限為1 mg/kg。

圖6 乳制品中三聚氰胺的檢測限

3 結 論

本實驗研究建立乳制品中三聚氰胺的免疫親和凝膠檢測柱分析方法，方法檢測限為200 μg/L。該檢測柱具有良好的特異性，除與環丙氨嗪有一定的交叉反應外，與其他結構類似物和獸藥均沒有交叉反應。針對乳制品中三聚氰胺的檢測限為1 mg/kg。本方法檢測快速，樣品前處理簡單，結果易于判斷。牛奶樣品僅需稀釋就可直接檢測，用時少，約15 min即可完成整個樣品處理和檢測過程，適合乳制品中三聚氰胺的現場快速檢測，具有良好的應用前景。

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Gel-based immunoaffinity test columnmethod for the detection of melamine in dairy products

QI Yujie,SHENG Wei,WANG Junping,ZHANG Yan,WANG Shuo

(Tianjin University of Science and Technology,College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin 300457，China)

A new gel-based immunoaffinity test column method for detecting melamine in the dairy productswas developed.MEL-HRPcon?jugatewas prepared using activated ester method.Melamine antibody and HRP antibody were coupled with the CNBr-activated agarose gel to prepare the test layer and control layer,respectively.The limit of detection(LOD)of this assay was 200 μg/L,and the LOD of melamine in dairy products was 1 mg/kg.The method has good specificity,it showed no cross-reactivity with the structural analogues and other veteri?nary drugsexcept cyromazine.This method is simple and easy to judge the result,the entire detection process can be finished within 15 min,which can be used as a usefull tool for the detection of melamine.

gel-based immunoaffinity test column;melamine;dairy products

TS252.7

A

1001-2230（2017）08-0047-04

2016-12-20

“十二五”科技支撐計劃(2013BAD18B11)；國家國際科技合作專項項目(2014DFR30350)。

齊玉杰（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測。

王碩