高效液相色譜-柱后衍生法測定保健品中維生素B1的含量*

何孟杭，潘丹婷，梁敏，黃何何，戴明

（1. 福建省產品質量檢驗研究院 國家加工食品質量監督檢驗中心，福建 福州 350002；2. 中國人民解放軍第180醫院，福建 泉州 362000）

高效液相色譜-柱后衍生法測定保健品中維生素B1的含量*

何孟杭1，潘丹婷2，梁敏1，黃何何1，戴明1

（1. 福建省產品質量檢驗研究院 國家加工食品質量監督檢驗中心，福建 福州 350002；2. 中國人民解放軍第180醫院，福建 泉州 362000）

文章建立了測定保健品中維生素B1含量的高效液相色譜-柱后衍生法。方法采用色譜柱：UltimateXB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：（0.01%辛烷磺酸鈉+1.5 %乙酸+5%甲醇+0.12%三乙胺）-甲醇（65∶35）；流速：1.0 mL /min；柱溫：35℃；檢測波長：Ex= 375nm，Em= 435nm。研究發現該柱后衍生法測定同一樣品中維生素B1含量得到的峰面積是柱前衍生法測定結果的1.6-18.8倍，維生素B1含量在0.01-32μg/mL范圍內線性良好，R2=0.999，檢出限為1 ng/mL。該方法靈敏、簡便、準確，重現性好，可用于保健品中維生素B1含量的測定。

維生素B1；高效液相色譜；柱后衍生法

維生素B1，又稱硫胺素或抗神經炎素，在體內以輔酶形式參與糖的分解代謝，有保護神經系統的作用；還能促進腸胃蠕動，增加食欲，是一種常見的輔助藥物[1]。如果人體長期缺乏維生素B1會引起糖代謝障礙和多發性神經炎及腳氣病[2]。在中華人民共和國國家標準的相關規定中，維生素B1的檢測方法主要有紫外-可見分光光度法[3]、熒光分光光度法[4-6]、化學分析法[7-9]、高效液相色譜法[4,10]等。目前，維生素B1的檢測多采用柱前衍生-液相色譜-熒光檢測法。但由于柱前衍生法存在一些缺點：1.形成的副產物可能對色譜分離造成較大困難；2.在衍生化過程中，容易引入雜質或干擾峰，或使樣品損失；3.檢測樣品中很可能含有維生素C等還原性的物質，該類物質可與鐵氰化鉀發生氧化還原反應，從而干擾硫色素反應，使衍生反應不完全，進而影響維生素B1的定量。因此，文章采用將維生素B1在柱后衍生為熒光產物，避免了樣品中還原性物質（如維生素C）與衍生劑中的鐵氰化鉀發生氧化還原反應，運用高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測法對維生素B1進行定性、定量，同時與高效液相色譜-柱前衍生法的測定結果進行比較。

1 c儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀；Waters 2475熒光檢測器；Waters柱后反應器；電熱手提高壓蒸汽消毒器（上海醫用核子儀器廠）；臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；pH試紙（杭州特種紙業有限公司）；維生素B1對照品（上海安普科學儀器有限公司）；甲醇、辛烷磺酸鈉為色譜純；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品柱前衍生分析

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：0.05 mol/L醋酸鈉（pH=4.5）的磷酸鹽溶液；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃，檢測波長：Ex= 375nm，Em=435nm；進樣量：10μL。

2.1.2 樣品提取

稱取一定量樣品于錐形瓶中，加45ml蒸餾水溶解，再加入5ml濃度為 2mol/L的HCl溶液，錫箔紙封口，置于電熱手提高壓蒸汽消毒器中，在125℃條件下消解30 min后取出，迅速冷卻；用15%的KOH溶液調節pH至5，轉移至100ml容量瓶中，定容，過濾。

2.1.3 提取液柱前衍生化

取上述濾液1.00mL于10mL具塞比色管中，加入1mL堿性鐵氰化鉀溶液，充分混勻后，加5.00mL正丁醇，強烈振蕩后靜置約10min，充分分層，吸取正丁醇相（上層）于4000～6000r/min離心5min，取上清液經有機微孔濾膜（0.45μm）過濾，供進樣用。另取1.00mL，濃度為4.12μg/mL的維生素B1對照品溶液，與試液同步進行衍生化。

2.2 樣品柱后衍生分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：（0.01 %辛烷磺酸鈉+1.5 %乙酸+5%甲醇+0.12 %三乙胺）-甲醇（65∶35）；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；以堿性鐵氰化鉀溶液作衍生劑，流速：0.45mL/min；進樣量：10μL；檢測波長：Ex=375nm，Em= 435nm；進樣量：10μL。

2.2.2 供試品提取

供試品提取步驟同2.1.2處理后，再取濾液經有機微孔濾膜（0.45μm）過濾，供進樣用。

2.3 方法的線性范圍及檢出限實驗

在優化后的實驗條件下對不同濃度的維生素B1標準溶液進行分析，以維生素B1的濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線（圖1），由實驗得出維生素B1在0.01～32μg/mL濃度范圍內呈線性關系，回歸方程為：Y=1.175×108X-8.09×106，R2=0.999。以3倍信噪比（S/N）計算方法檢出限為1 ng/mL。

圖1 維生素B1標準溶液濃度與峰面積的關系圖

2.4 加標回收率實驗

回收率實驗以不含維生素B1的某品牌保健品為空白基質，進行0.05、0.5、5μg /g 3個濃度水平的添加回收試驗，每個濃度水平重復5次，得到維生素B1的回收率和精密度列于表1。

表1 加標回收率實驗結果（n=5）

2.5 柱前衍生法和柱后衍生法測定樣品中維生素B1含量的結果比較

2.5.1 對照品溶液的測定結果比較

實驗中我們考察了柱前衍生-HPLC和柱后衍生-HPLC對同一維生素B1標準溶液的測定情況，圖2為這2種方法測定維生素B1的色譜圖，從實驗結果可知，柱前衍生法（圖2(1)）中維生素B1的保留時間短，峰面積為9664842，柱后衍生法（圖2(2)）中維生素B1的保留時間長，且峰面積為90353315。

圖2 柱前衍生-HPLC（1）與柱后衍生-HPLC（2）測定維生素B1標準溶液的色譜

2.5.2 供試品溶液的測定結果比較

實驗還考察了3種供試品采用柱前衍生-HPLC和柱后衍生-HPLC對維生素B1含量的測定，2種方法測定每種供試品的實驗數據見表2和表3。數據結果可以得出，柱后衍生法測定同一供試品中維生素B1得到的峰面積是柱前衍生法測定結果的1.6-18.8倍，說明柱后衍生法降低了柱前衍生存在的負影響，提高了檢測方法的靈敏度，該方法用于保健品中維生素B1含量的測定是可行的。

表2： 柱前衍生法測定3種供試品溶液實驗數據

表3：柱后衍生法測定3種供試品溶液實驗數據

3 討論

3.1 提取條件的優化

由于維生素B1為白色結晶體，易溶于水，在酸性溶液中很穩定，在堿性溶液中不穩定，易被氧化，受熱易被破壞，所以溶劑均以HCl為調節劑[1]。維生素B1在pH=2的HCl溶液中以分子狀態存在，穩定性良好，但pH＞5時，將會分解[11]。因此，樣品經酸水解后，選擇用15%的KOH溶液調節pH至5，以確保試驗在酸性環境中進行，便于結果的準確性。

3.2 分離模式的優化

維生素B1是由氨基嘧啶環和噻唑環通過亞甲基連接而成的季銨類化合物，噻唑環上的季銨及嘧啶環上的氨基為兩個堿性基團，可與酸成鹽?？紤]到維生素B1在一定條件下可以以離子形式存在，因此采用離子對模式進行分離。而離子對色譜法中，分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如辛烷磺酸鈉可與堿性樣品形成很強的離子對。同時，離子對色譜法常采用C18柱，在一定的pH范圍內進行分離。因此，文章以辛烷磺酸鈉為離子對試劑，用C18柱以反向離子對模式進行分離。

3.3 流動相的優化

方法在文獻[12]的基礎上，選擇了辛烷磺酸鈉作為離子對試劑來分離測定水溶性維生素。實際操作中發現，流動相中不加三乙胺，維生素B1的峰形嚴重拖尾；加入三乙胺后，各峰的峰形和分離度均顯著改善，保留時間也大大減少。通過反復試驗，優化出最佳流動相條件為（0.01%辛烷磺酸鈉+1.5%乙酸+5%甲醇+0.12%三乙胺）-甲醇（65∶35）。采用該流動相，分離效果好，且容量因子適中，結果滿意。

4 結論

結果表明，方法較好地解決了樣品維生素B1的提取、凈化與雜質分離等問題。該方法具有專屬性強、線性范圍廣、靈敏度高、樣品處理簡便的優點，同時還可避免還原性物質等對化學衍生反應的干擾，是保健品中維生素B1含量測定較理想的方法。

[1] 楊曉玲，李愛民，李紹賢.HPLC法測定維生素B1的含量[J].安徽醫藥,2006(12)：928-92.

[2] 田林芹，張愛梅.動力學光度法測定維生素B1的研究[J].理化檢驗,2005,41(4)：255-258.

[3] 國家藥典委員會,中華人民共和國藥典(二部)[M].北京：化學工業出版社,2010：896-897.

[4] 全國飼料工業標準化技術委員會.飼料中維生素B1的測定：GB/T 14700-2002[S].北京：中國標準出版社，2003：3.

[5] 中華人民共和國衛生部.食品中硫胺素（維生素B1）的測定：GB/T 5009.84-2003[S].北京：中國標準出版社，2004：1.

[6] 全國糧油標準化技術委員會.谷物中維生素B1測定：GB/T 7628-2008[S]. 北京：中國標準出版社，2008：10.

[7] 全國飼料工業標準化技術委員會.飼料添加劑 維生素B1（鹽酸硫胺）：GB/T 7295-2008[S].北京：中國標準出版社，2008：5.

[8] 全國飼料工業標準化技術委員會.飼料添加劑 維生素B1（硝酸硫胺）：GB/T 7296-2008[S].北京：中國標準出版社，2008：6.

[9] 中華人民共和國衛生部.食品添加劑 維生素B1（鹽酸硫胺）：GB 14751-2010[S].北京：中國標準出版社，2011：2.

[10] 全國肉禽蛋制品標準化技術委員會.肉與肉制品維生素B1含量測定：GB/T 9695.27-2008[S].北京：中國標準出版社，2008：11.

[11] 楊政,蔣俊春,孫碩遠.差示分光光度法測定維生素B1片的含量[J].醫藥論壇雜志,2006,27(15)：108.

[12] 盧慧卿.高效液相色譜-熒光檢測法測定復合維B片中維生素B1含量[J].中國藥業,2008,17(15)：24-25.

10.3969/j.issn.1007-550X.2017.03.002

O657.7+2

A

1007-550X（2017）03-0036-04

福建省質量技術監督局科技項目（FJQI2014037）

2017-01-10

何孟杭（1985- ），男，福建寧德人，工程師，碩士研究生，主要從事食品加工技術研究。