反相高效液相法分析羅漢果皂苷V

李飛妍++黃玲++萬紅麗

基本知識

（1）皂苷V的基本知識

皂苷是羅漢果中的一種非糖甜味成分，為極性較強(qiáng)的大分子化合物，不易結(jié)晶，易溶于水和醇，難溶于有機(jī)溶劑，具多種生物活性。

皂苷V（又稱甜苷V）易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑，不溶于石油醚、氯仿等低極性有機(jī)溶劑。

（2）反相高效液相色譜法（RP-HPLC）的分離機(jī)理

RP-HPLC是高效液相色譜法中較常用的分離方法，其機(jī)理是采用流動相極性大于固定相的流動相來分離含極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物；分子在反相色譜柱中是按其極性的大小移動，極性越大被洗脫出越快；

選題意義及國內(nèi)外發(fā)展?fàn)顩r

近年，甜苷類化合物越來越吸引人們注意，而目前我國對羅漢果皂苷提取物的分離、純化以及含量測定的研究依然極少。

皂苷V是甜苷中的主要甜味成分，羅漢果甜苷類產(chǎn)品質(zhì)量一般以羅漢果皂苷V的含量來評價(jià)。故對皂苷V提取和含量分析具重要的意義。

反相高效液相色譜法測定羅漢果中皂苷V的含量

實(shí)驗(yàn)用品。

（1）材料

羅漢果干果；羅漢果甜苷V標(biāo)準(zhǔn)品來源：中國藥品生物制品鑒定所；純度（R）：100%

（2）主要試劑

乙睛（色譜純）、蒸餾水、甲醇（分析純）、乙醇（分析級）

（3）使用儀器

高效液相色譜儀、電子天平、粉碎機(jī)、紫外-可見分光光度計(jì)、多用途恒溫超聲提取機(jī)、電熱恒溫干燥箱

實(shí)驗(yàn)步驟。

（1）羅漢果的預(yù)處理

將羅漢果干果粉碎成粉末后，置于60℃左右干燥箱中，干燥4h后密閉保存，備用。

（2）提取方法的確定（常規(guī)水煮法、超聲法和加熱回流的比較）

經(jīng)過查閱超聲、常規(guī)水煮及加熱回流提取羅漢果中甜苷V的相關(guān)資料，在各方法最佳條件下：常規(guī)水煮法對羅漢果甜苷的提取率為2.43%，而羅漢果甜苷的含量在3.76～3.86%范圍內(nèi)，故提取不完全；超聲法（3.59%）和加熱回流法（3.55%）對羅漢果甜苷的提取率差不大，而加熱回流法對羅漢果甜苷的最佳提取所用的時(shí)間是超聲法的4倍，且繁瑣復(fù)雜。從而確定超聲法為本實(shí)驗(yàn)的提取方法。

（3）對照品溶液的配制

精密稱取皂苷V標(biāo)準(zhǔn)品10.34mg，用23%的乙睛定容于50ml容量瓶中，配制成0.2068mg/ml的對照品儲備液。

（4）樣品溶液的制備

（5）波長的選擇

將制好的皂苷V對照品溶液和樣品溶液于分光光度計(jì)下進(jìn)行波長測定，發(fā)現(xiàn)2者在203nm處吸收峰均為最大，故令檢測波長為203nm。

（6）色譜體系的確立

①色譜柱的選擇

羅漢果中含有多種三萜皂苷類化合物，具相同苷元，結(jié)構(gòu)類似，極性極相近，其區(qū)別僅在于所連接的葡萄糖基不同；而-NH2為堿性，具強(qiáng)氫鍵結(jié)合能力，對某些多官能團(tuán)化合物具好分離。故選氨基柱為檢測的色譜柱，通過氨基鍵合相上的-NH2與糖類分子中的-OH間選擇性相互作用，從而使皂苷達(dá)到很好分離效果。故采用NH2柱作為實(shí)驗(yàn)的色譜柱，使羅漢果皂苷被有效洗脫

②流動相的確定

由于高效液相色譜中所用的流動相為液體，組分在流動相中受到親和力的作用。故對組分的分離度，流動相起很大影響；經(jīng)由查閱相關(guān)資料，乙睛-水溶液對羅漢果皂甙分離效果較好：本文研究了20%～25%的乙腈水溶液對羅漢果甜苷分離效果。發(fā)現(xiàn)各色譜峰能較好分離所用乙腈水溶液為23%。低于23%的乙腈水溶液為流動相時(shí)，洗脫能力低，主峰與雜質(zhì)峰重疊現(xiàn)象嚴(yán)重；隨著乙腈-水溶液的濃度增加（由23%→25%）時(shí)，分析時(shí)間↓，洗脫能力↑，但分離時(shí)間延長，甚至主峰不出現(xiàn)。

綜上，可確定23%乙腈水溶液為本實(shí)驗(yàn)的流動相。

③色譜的分析條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2柱（4.6mmID×250mm 5um）；流動相：乙腈水溶液（乙腈：水=23：77），用氨水調(diào)pH=7.0；流速v=1.2mL/min取波長λ=203nm進(jìn)行檢測；進(jìn)樣量：10.000μL；定量方法：外標(biāo)法；檢測靈敏度：0.08；柱溫：22.5℃；柱壓：1.0MPa；濕度：59%。

（7）羅漢果甜苷V色譜峰的判定

本實(shí)驗(yàn)利用甜苷中分子極性差異來分離出羅漢果甜苷V，極性大的先出，極性小的后流出。對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，由保留時(shí)間來判斷出樣品的色譜峰。甜苷提取物在RP-HPLC柱中進(jìn)行分離時(shí)，羅漢果苷均在皂苷V前出。故羅漢果各苷對皂苷V的分離純化無大的影響。

（8）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按2.2.6條件下，精密吸取10.000?L的皂苷V對照品溶液和樣品溶液各一份，進(jìn)行高效液相色譜儀的測定。結(jié)果：皂苷V在色譜柱上的tR=10.5min。皂苷V與其相鄰雜峰實(shí)現(xiàn)了基線分離，分離度R>1.5，對照品溶液與樣品液得到了充分的洗脫和良好的分離。按羅漢果苷V峰面積的理論塔板數(shù)N≥5000。

（9）回歸方程

準(zhǔn)確吸取皂苷V對照品溶液（0.2068mg/ml）的2?L、5?L、10?L、30?L、50?L分別進(jìn)樣，結(jié)果為：回歸方程Y=45.779+0.7406（n=5），相關(guān)系數(shù)r^2=0.9999，羅漢皂苷V進(jìn)樣量在2～50?L內(nèi)與峰面積具很好線性關(guān)系，即皂苷V含量的線性范圍為0.4172～10.4300 ?g。

（10）樣品測定

精密吸取皂苷V樣品溶液10.000μL，進(jìn)樣，在2.2.6條件下平行測定3次，皂苷V濃度（C/mg·ml-1）分別為0.16023、0.1605、0.1560，對應(yīng)的皂苷V的色譜峰面積（mAU·s）分別為355.5632、356.0322、354.7482，羅漢果質(zhì)量為0.5M/g，計(jì)算所含皂V的含量（%）分別為1.6507、1.6529、1.6469，即皂苷V的平均含量為1.6502%。

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證。

（1）精密度考察

精密吸取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10?L，在2.2.6條件下測定，記錄皂苷V的峰面積（mAU·s）分別為458.2954、455.1334、450.0102、454.9787、456.2344，平均值454.9304；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）為0.6710%（n=5），表明本實(shí)驗(yàn)所用的儀器具良好精密度。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液，隔60min進(jìn)樣一次，平行5次，按2.2.6條件測峰面積，進(jìn)樣時(shí)間/min為0、60、120、180、240分別對應(yīng)的峰面積（mAU·s）為358.0511、354.9897、360.1955、353.1956、357.0984；平均為356.70606 mAU·s

由結(jié)果，可知待測組分在0～240min內(nèi)，色譜峰面積未明顯改變，經(jīng)計(jì)算，RSD為0.7601；則被測物在0～240min內(nèi)保持穩(wěn)定。

（3）重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.1”預(yù)處理，精密稱取0.5g粉末，共6份。分別按“2.2.4”制備甜苷V供試品溶液，按“2.2.6”條件進(jìn)樣（每次10?g）；HPLC法測定并計(jì)算含苷V的含量，得到RSD 0.5457%，說明本實(shí)驗(yàn)所用的分析羅漢果甜苷V的方法重復(fù)性高。

（4）考察加樣回收率試驗(yàn)

稱取一定量的含量為1.6502%的羅漢果干果按“2.2.1”預(yù)處理；精密稱取干燥的羅漢果粉約0.45g，共6份；每份按“2.2.4”法制備供試品溶液后，分別精密加入4mL的 0.2068mg/ml甜苷V對照品溶液，再按“2.2.6”項(xiàng)測定其含量，所得平均回收率為99.1301%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6126%，故本實(shí)驗(yàn)回收率好，準(zhǔn)確度高。

結(jié)論

（1）從常規(guī)水煮、超聲法和加熱回流3種提取法中，確定超聲提取羅漢果甜苷是最有效的：以甲醇提取，料液比1：30，功率800W，頻率26.8KHZ，常溫提取約30min。該法很大程度提高了羅漢果甜苷的提取率與提取速度。

（2）用Shodex Asahipak NH2柱分離羅漢果甜苷V，為制備甜苷V對照品的提供很好途徑。

（3）以NH2柱為色譜柱的基礎(chǔ)上，建立了RP-HPLC法分析羅漢果甜苷V【色譜柱：Shodex AsahipakNH2柱（4.6mmID×250mm 5um）；流動相：乙腈水溶液（乙腈：水=23：77），用氨水調(diào)pH=7.0；檢測波長：203nm；流速：1.2mL/min；進(jìn)樣量：10.000μL；檢測靈敏度：0.08；柱溫：22.5℃；柱壓：1.0MPa；濕度：59%。】

（4）本文所建立的RP-HPLC法，系統(tǒng)適用性好，可使皂苷V與其相鄰雜峰實(shí)現(xiàn)了基線分離，并得到充分洗脫和良好分離，通過主要色譜峰洗脫液收集，再濃縮、重結(jié)晶冷和凍干燥，可得到皂苷V的白色結(jié)晶粉。

（5）本文所建立的定量分析皂苷V的RP-HPLC法精密度、準(zhǔn)確性好，重現(xiàn)性、回收率高，且樣品前處理較易，提取與檢測時(shí)間較短，故可用于羅漢果及其制品中羅漢果甜苷V的分析，從而有效進(jìn)行甜苷V的含量測定及質(zhì)量評價(jià)。