戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用研究

侯玉鳳，周 宇,2，王愛玲，吳萌萌，張為民，周宏超，張彥明，郭抗抗*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.延安市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西延安716000)

戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用研究

侯玉鳳1，周 宇1,2，王愛玲1，吳萌萌1，張為民1，周宏超1，張彥明1，郭抗抗1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.延安市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西延安716000)

為評價戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑在不同條件下對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果，通過懸液定量殺菌試驗探究了戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑在不同環(huán)境溫度(4 ℃、25 ℃、37 ℃)、不同作用時間(1 min、5 min、10 min)以及存在有機(jī)干擾物(3%、25%的牛血清白蛋白)等條件下對豬源大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用。結(jié)果顯示，在沒有有機(jī)物干擾時，濃度為167 mg/L的戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑在4 ℃、25 ℃、 37 ℃下均可在5 min內(nèi)完全殺滅2種受試菌(107CFU)，說明環(huán)境溫度對該復(fù)合劑的殺菌作用影響不明顯。當(dāng)有機(jī)物濃度為3%時，該復(fù)合劑在10 min內(nèi)完全殺滅大腸埃希菌的最低濃度為250 mg/L，金黃色葡萄球菌為125 mg/L；有機(jī)物濃度為25%時，作用時間不低于10 min，完全殺滅大腸埃希菌的最低濃度為1000 mg/L，金黃色葡萄球菌為1250 mg/L。有機(jī)物含量高殺滅相同數(shù)量受試菌所需復(fù)合劑的量也需要加大、作用時間延長，說明有機(jī)干擾物對復(fù)合劑的殺菌作用影響較大。本研究結(jié)果提示，為達(dá)到較好的殺菌效果，養(yǎng)殖場在使用戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑時的有效濃度應(yīng)不低于1250 mg/L，作用時間10 min以上時殺菌效果更好。

戊二醛-癸甲溴銨；大腸埃希菌；金黃色葡萄球菌；消毒；殺菌率

Correspondingauthor:GUOKang-kang,E-mail:guokk2007@nwsuaf.edu.cn

Abstract: To evaluate the bactericidal effect of glutaraldehyde-deciquam onEscherichiacoliandStaphylococcusaureusin different environmental conditions, the suspension quantitative germicidal test was carried at different temperatures ( 4 ℃, 25 ℃, 37 ℃), disinfecting time (1 min, 5 min, 10 min) and organic interference (3%, 25% bovine serum albumin). The results showed that 167 mg/L of this disinfectant disinfect the target bacteria completely within 5 min at 4 ℃, 25 ℃and 37 ℃without bovine serum albumin, indicating the slight influence of environmental temperature on bactericidal effect. The concentration of this disinfectant disinfectEscherichiacoliandStaphylococcusaureuscompletely within 10 minutes were 250 mg/L and 125 mg/L with 3% bovine serum albumin, respectively. However, the concentration of this disinfectant disinfectEscherichiacoliandStaphylococcusaureuscompletely within 10 minutes were 1000 mg/L and 1250 mg/L with 25% bovine serum albumin, respectively. It showed that higher level concentration and longer disinfecting time were needed for glutaraldehyde-deciquam completely disinfect same amounts of tested bacteria in the environmental condition with higher level organic interference. The results in present study suggests that the concentration no less than 1250 mg/L and the disinfecting time no less than 10 minutes for this disinfectant used in swine farm which can be conducted to obtain better bactericidal effect.

Keywords: glutaraldehyde-deciquam;Escherichiacoli;Staphylococcusaureus; disinfectant; sterilizing rate

隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，規(guī)模化、集約化程度越來越高，在帶來良好養(yǎng)殖效益的同時，豬的疫病也不斷發(fā)生，成為困擾養(yǎng)豬業(yè)的一個重大問題。當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原較多，可分為病毒性病原、細(xì)菌性病原、寄生蟲性病原等，為了減少和杜絕傳染性病原在豬群中的傳播，做好生物安全措施至關(guān)重要。消毒是豬場生物安全體系的重要環(huán)節(jié)，做好平時的消毒工作，能夠減少病原微生物的數(shù)量，減少動物的感染和發(fā)病[1-3]。目前，市場上的消毒劑種類繁多，作用效果也受到各種因素的影響而不盡相同。

戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑是養(yǎng)殖場常用的一種消毒劑，前期對豬場常見病原菌的殺滅效果也受到多種因素影響。調(diào)查表明因大腸埃希菌引起的仔豬腹瀉和因金黃色葡萄球菌引起豬的急性、亞急性、慢性乳房炎等疾病在采取消毒措施的規(guī)模化豬場仍比較常見[4-5]，部分原因是一些規(guī)模化養(yǎng)豬場技術(shù)人員對消毒劑的使用方法不當(dāng)造成的。消毒劑的作用受到藥物濃度、環(huán)境溫度、作用時間、微生物的種類和數(shù)量、環(huán)境中有機(jī)干擾物的多少等諸多因素的影響。武守艷[6]、徐秀榮[7]等對戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用進(jìn)行了研究，為其合理使用提供了試驗依據(jù)。考慮到豬場由于長期使用消毒劑及使用藥物，會造成一些耐藥菌株的產(chǎn)生，降低藥物的使用效果，本研究以從發(fā)病豬上分離的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌為受試菌，評價戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑在不同條件下對受試菌的作用效果，為豬場更好地使用該消毒劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬源大腸埃希菌(E.coli)、豬源金黃色葡萄球菌(S.aureus)分離株均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)實驗室分離、鑒定、保存。該兩個分離株均為從患病豬上分離得到，但未進(jìn)行血清分型。

1.1.2 主要試劑 牛血清白蛋白、吐溫-80、甘氨酸、普通營養(yǎng)瓊脂均購自杭州天和微生物試劑有限公司；戊二醛、癸甲溴銨等試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。PBS(含KCl 0.2 g，NaCl 8.0 g，KH2PO40.1 g，Na2HPO4·12H2O 2.036 g，溶于1 L超純水，調(diào)整pH至7.4， 121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。)。LB液體培養(yǎng)基(酵母提取物1.0 g，胰蛋白胨2.0 g，NaCl 2.0 g，溶于200 mL超純水調(diào)整pH至7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。4 ℃保存)。LB固體培養(yǎng)基(在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加3 g瓊脂粉，其余操作同LB液體培養(yǎng)基)。

1.1.3 戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑及其中和劑的配制

戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑：取100 g的戊二醛和100 g的癸甲溴銨于1 L超純水中，配制成濃度為100 g/L的溶液。中和劑：取3 mL的吐溫-80、1 g甘氨酸溶于97 mL的PBS中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 受試菌株的復(fù)蘇 將大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌凍干粉接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，每個菌種接種3管，37 ℃培養(yǎng)18 h。用接種環(huán)挑取菌液在LB固體培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑單個菌落于50 mL LB液體培養(yǎng)基中增菌，37 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 受試菌懸液的制備 按照《消毒技術(shù)規(guī)范》[8]和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》[9]中的有關(guān)規(guī)定，采用10倍稀釋法，滅菌用PBS溶液將受試菌分別調(diào)整為1×107～5×108CFU/mL。

1.2.3 戊二醛-癸甲溴銨中和劑的中和作用試驗 按照《消毒技術(shù)規(guī)范》[8]和韓杰等[10]方法，用3%的吐溫-80+1%的甘氨酸的混合液為戊二醛-癸甲溴銨的中和劑，用受試的大腸埃希菌進(jìn)行中和試驗。將符合消毒劑試驗要求的菌懸液與消毒劑按1︰9進(jìn)行混合、作用。

中和劑試驗分以下6組。第1組：消毒劑+菌懸液；第2組：(消毒劑+菌懸液)+中和劑；第3組：中和劑+菌懸液，用以驗證中和劑是否抑菌；第4組：(消毒劑+中和劑)+菌液；第5組：稀釋液+菌懸液，作為陽性對照；第6組：稀釋液+中和劑，作為陰性對照。

1.2.4 懸液定量殺菌試驗

1.2.4.1 無有機(jī)干擾物時戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑的殺菌作用 在不同的消毒劑濃度、環(huán)境溫度、作用時間條件下，對戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果進(jìn)行研究。

用PBS溶液將戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑(100 g/L)分別配制成500、250、167、125 mg/L的溶液。分別吸取配制好的復(fù)合劑溶液4.5 mL于滅菌試管中，再取受試菌液0.5 mL于另一無菌的試管中，置于37 ℃、25 ℃和4 ℃條件下平衡20 min；然后將平衡好溫度的0.5 mL菌液加入到4.5 mL復(fù)合劑中，充分混勻；在平衡好的溫度條件下分別作用1 min、5 min后，取0.5 mL反應(yīng)液于一新的無菌試管中，加入4.5 mL中和劑溶液，混勻后作用10 min，取100 μL接種于LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后置37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計數(shù)(每個反應(yīng)管做2個板)，計算不同條件下的殺菌率。以滅菌PBS溶液取代消毒液，其他條件不變作為陽性對照；以滅菌PBS溶液取代消毒劑和菌液，其他條件不變作為陰性對照。每個條件下的實驗重復(fù)三次。

1.2.4.2 存在有機(jī)干擾物時戊二醛-癸甲溴銨對受試菌的殺滅作用 在制備好的受試菌菌懸液中加入牛血清白蛋白，使終濃度分別為3%和25%。選擇戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑在無蛋白干擾下的最低有效殺菌劑量，在25 ℃下進(jìn)行懸液定量殺菌試驗，作用時間分別為1 min、5 min和10 min；如果消毒劑的最低有效殺菌劑量不能進(jìn)行有效的殺滅時，在此基礎(chǔ)上提高復(fù)合劑的濃度，再進(jìn)行懸液定量殺菌試驗。通過菌落計數(shù)，評價殺菌效果。

2 結(jié) 果

2.1 戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑的中和劑作用結(jié)果

分別用滅菌PBS溶液將受試菌濃度調(diào)整到107CFU/mL，滿足試驗的需要。根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》中和劑鑒定合格判斷標(biāo)準(zhǔn)。從表1可以看出，在戊二醛-癸甲溴銨濃度為500 mg/L時，第1、2組無菌落生長；第 3、4、5組之間的菌落誤差率≤15%；第6組無菌落生長。實驗結(jié)果說明，3%吐溫-80+1%的甘氨酸可以作為戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑的中和劑。中和劑、中和劑與消毒劑的反應(yīng)產(chǎn)物對大腸埃希菌生長均無影響，滿足試驗要求。

表1 戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑中和劑的作用結(jié)果Tab 1 The result of neutralizer for glutaraldehyde-deciquam

表中結(jié)果為三次試驗的平均值；25 ℃，作用5 min

The average of the results for three times trial；at 25 ℃ for 5 min

2.2 無有機(jī)干擾物時戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑的殺菌作用 表2結(jié)果顯示，在沒有有機(jī)物干擾時，戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑濃度≥167 mg/L時，在4 ℃、25 ℃、37 ℃下分別作用5 min，對兩種受試菌的殺菌率均可達(dá)到100%。在試驗溫度下可見溫度對戊二醛-癸甲溴銨的殺菌作用影響不大。

表2 無有機(jī)干擾物時戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑對受試菌的殺滅結(jié)果Tab 2 Bactericidal effect of glutaraldehyde-deciquam on tested bacteria at different temperature without organic interference

2.3 存在有機(jī)干擾物時戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑對受試菌的殺菌作用 本試驗在25 ℃條件下進(jìn)行。當(dāng)有機(jī)物濃度為3%時，戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑在不少于10 min的作用時間下，100%殺滅兩種受試菌的最低有效濃度為250 mg/L。當(dāng)有機(jī)物濃度為25%時，戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑在不少于10 min的作用時間下，100%殺滅大腸埃希菌的最低有效濃度為1000 mg/L，100%殺滅金黃色葡萄球菌的最低有效濃度為1250 mg/L。結(jié)果見表3，提示有機(jī)干擾物對消毒劑殺菌作用有較大的影響，在豬場環(huán)境衛(wèi)生狀況不好時會對消毒劑的殺菌作用有較大的影響。

表3 存在有機(jī)干擾物時戊二醛-癸甲溴銨對受試菌的殺滅作用結(jié)果Tab 3 Bactericidal effect of glutaraldehy-deciquam on tested bacteria in different temperature with organic interference

3 討 論

戊二醛是一種速效、廣譜的化學(xué)殺菌劑，對多種微生物表現(xiàn)出殺滅活性，對繁殖型的細(xì)菌、病毒、分枝桿菌、致病性霉菌和細(xì)菌芽孢等均有殺滅作用，且對人毒性較低。癸甲溴銨不僅能與陽離子、非離子、兩性離子表面活性劑配伍，與乙醇、異丙醇等溶劑復(fù)配成復(fù)合制劑，耐溫、耐光，而且能殺滅細(xì)菌繁殖體、真菌、病毒，屬高效消毒劑[11]。癸甲溴銨消毒劑對細(xì)菌、真菌、親脂性病毒有效，但對芽孢作用有限，而戊二醛消毒劑對芽孢殺滅作用顯著，二者的結(jié)合不僅可以彌補(bǔ)單一消毒劑使用的缺陷，還可以增強(qiáng)殺菌效果和消毒劑穩(wěn)定性。季銨鹽與細(xì)菌細(xì)胞壁膜上的多磷脂反應(yīng)，也能使細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽變性，隨后戊二醛破壞細(xì)菌表面的蛋白受體。戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合消毒劑在生產(chǎn)中主要應(yīng)用于豬舍環(huán)境、消毒池消毒。本研究發(fā)現(xiàn)戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合消毒劑在相同的濃度和相同的作用時間對金黃色葡萄球菌的殺菌率高于大腸埃希菌，但具體殺菌機(jī)制有待深入研究。

影響消毒劑殺菌效果的主要因素是消毒劑的濃度、作用時間、溫度、微生物的種類和數(shù)量以及畜舍有機(jī)物的干擾。研究發(fā)現(xiàn)，溫度每升高10 ℃消毒劑的殺滅率提高2～3倍，當(dāng)豬舍內(nèi)溫度≤16 ℃時，消毒劑對病原微生的殺滅率將會降低；同時，畜舍的糞便的清理程度將會影響消毒劑的殺菌效果[12-13]。戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合消毒劑比單體溶液殺菌作用更顯著[7]。合理、有效地使用消毒劑，控制消毒劑污染，對動物疫病防控、環(huán)境保護(hù)、養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展都有著現(xiàn)實重要意義。本研究以豬場常見的病原菌大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌為受試菌，研究了戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑在不同的濃度、溫度及不同含量有機(jī)物干擾下對受試菌的殺滅作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)境溫度對該消毒劑的殺菌作用影響不大，消毒劑濃度、作用時間及有機(jī)物的干擾等因素對其殺菌作用有較大的影響。所以，在豬場使用消毒劑時，為保證有更好的殺滅效果，建議養(yǎng)殖場定期打掃畜舍環(huán)境衛(wèi)生，盡量減少有機(jī)物對消毒劑殺菌作用的干擾。在使用戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑消毒時，有效濃度不低于1250 mg/L，作用時間在10 min以上；豬舍糞便、飼料等有機(jī)物含量較高時可適當(dāng)加大消毒劑濃度和延長作用時間。本研究為戊二醛-癸甲溴銨復(fù)合劑在豬場的使用提供了參考。

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(編輯：李文平)

BactericidalEffectofGlutaraldehyde-DeciquamonEscherichiacoliandStaphylococcusaureus

HOU Yu-feng1, ZHOU Yu1,2, WANG Ai-ling1, WU Meng-meng1, ZHANG Wei-min1, ZHOU Hong-chao1, ZHANG Yan-ming1, GUO Kang-kang1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China; 2.Yan’anCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Yan’anShaanxi, 716000,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.03

2017-02-15

A

1002-1280 (2017) 09-0012-06

S859.79

陜西省重點(diǎn)農(nóng)業(yè)科技示范推廣項目(ZDKJ-2014-33)

侯玉鳳，碩士研究生，從事豬重要疫病防控技術(shù)研究；周 宇，碩士研究生，獸醫(yī)師，從事動物疫病防控技術(shù)研究，為共同第一作者。

郭抗抗。E-mail: guokk2007@nwsuaf.edu.cn