葡萄乙醛脫氫酶VvALDH10A9基因的克隆、表達及酶活性分析

邢啟凱, 燕繼曄, 張 瑋, 劉 梅, 富春元, 李興紅

(北京市農林科學院植物保護環境保護研究所, 北京 100097)

葡萄乙醛脫氫酶VvALDH10A9基因的克隆、表達及酶活性分析

邢啟凱, 燕繼曄, 張 瑋, 劉 梅, 富春元, 李興紅*

(北京市農林科學院植物保護環境保護研究所, 北京 100097)

由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄潰瘍病Botryosphaeria dieback是葡萄上的主要枝干病害,嚴重影響葡萄產量和品質。鑒定和分析參與葡萄與葡萄潰瘍病菌互作的基因,有助于揭示和闡明葡萄抗潰瘍病的信號通路。本研究根據葡萄潰瘍病菌侵染后的葡萄轉錄組數據信息,利用逆轉錄聚合酶鏈式反應技術(RT-PCR)克隆了一個受葡萄潰瘍病菌誘導上調表達的乙醛脫氫酶基因VvALDH10A9(Vitisviniferaaldehyde dehydrogenase 10A9)。系統進化樹分析表明,該基因編碼的蛋白與擬南芥AtALDH10A8親緣關系最近。利用實時熒光定量PCR分析VvALDH10A9的表達結果表明:VvALDH10A9的表達具有組織特異性,在莖、葉和花中表達量最高,在根中表達量相對較低;葡萄潰瘍病菌侵染后,VvALDH10A9在葡萄抗病品種中表達變化不明顯,而在葡萄感病品種中該基因顯著上調表達。利用原核蛋白表達系統誘導合成的VvALDH10A9蛋白,經純化后可降解乙醛,表明VvALDH10A9蛋白具有乙醛脫氫酶活性。

葡萄; 葡萄潰瘍病; 乙醛脫氫酶;VvALDH10A9; 原核表達

葡萄Vitisvinifera不僅可以鮮食還可以釀酒、制干和制汁等,是全世界重要的水果之一,其產量和面積在世界水果中均位居前列[1]。改革開放以來,中國葡萄產業迅速發展,截至2013年底,中國葡萄栽培面積已達715.5萬hm2,葡萄總產量超1 150萬t(2014年度葡萄產業技術發展報告)。葡萄病害是影響葡萄產量和品質的最重要因素之一,據統計,危害我國葡萄的病害有40余種[2]。由葡萄座腔菌科真菌引起的葡萄潰瘍病作為一種嚴重的枝干病害近幾年才引起人們的重視,在世界上主要的葡萄栽培區域均有分布[3-5]。在我國,李興紅研究組2009年首次發現并報道了由葡萄座腔菌引起的葡萄潰瘍病,目前引起葡萄潰瘍病的病原菌共分離到5種,分別是Botryosphaeriadothidea、Diplodiaseriata、Lasiodiplodiatheobromae、Neofusicoccumparvum、Lasiodiplodiapseudotheobromae和Neofusicoccummangiferae[6-9]。通常認為,葡萄潰瘍病主要通過自然孔口或修剪傷口侵入,感病植株出現枝枯、潰瘍和果腐等現象,嚴重者發生根腐,致使整株枯死。葡萄潰瘍病已成為中國葡萄生產的重大障礙[6-7]。

醛是一類生物體內常見的生物分子,根據來源方式,可將其分為內源醛和外源醛。內源醛主要來自氨基酸、碳水化合物、維生素和脂類等物質的新陳代謝[10-11]。外源醛主要是指逆境環境脅迫過程中膜脂的過氧化反應產生的醛類[10-11]。由于其自身羰基基團的親電特性,這些代謝過程產生的醛很容易與細胞內的親和物質發生作用,對生物體造成一些嚴重的遺傳毒害[12]。因此,醛的選擇性代謝對機體功能至關重要。醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenases, ALDHs)是一類通過氧化各種內源性和外源性等多種醛的酶類,在煙酰型輔酶(NAD(P)+)的協助下,不可逆地將醛氧化形成相對應的羧酸,從而達到解毒的目的[13-14],該類蛋白質都含谷氨酸、半胱氨酸活性位點[15]。

到目前為止,在所有生物體中共發現超過550個不同的ALDH基因,根據蛋白質序列差異可分成22個醛脫氫酶家族[16-17],而植物中的醛脫氫酶分布于14個家族,并且其中的7個家族(ALDH11、ALDH12、ALDH19、ALDH21、ALDH22、ALDH23和ALDH24)為植物所特有[18]。張玉成等[19]從釀酒葡萄基因組中共篩選到23個醛脫氫酶基因,并將其分成10個家族,證實一些VvALDH基因在寄主葡萄和病原菌的互作以及果實的發育等過程中起著重要的作用。本研究前期以L.theobromae菌株CSS-01s、葡萄‘夏黑’(高感)為研究對象,采用RNA-seq技術對CSS-01s誘導后的‘夏黑’枝干進行轉錄組分析,通過差異表達基因的篩選與注釋,從轉錄組水平上分析感病葡萄對葡萄潰瘍病菌防御反應以及早期病程相關基因的表達,發現乙醛脫氫酶VvALDH10A9基因在誘導后的樣品中高表達。因此,本試驗通過對VvALDH10A9基因克隆、原核表達并測定其酶活,初步驗證VvALDH10A9蛋白的功能,旨在為揭示VvALDH10A9基因在葡萄潰瘍病菌侵染過程中的作用機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料:大腸桿菌Escherichiacoli菌株DH5α和BL21購自北京全式金生物技術有限公司,根癌農桿菌Agrobacteriumtumefaciens菌株EHA105及野生型L.theobromae菌株CSS-01s均由本實驗室保存。一年生‘梅鹿轍’(Merlot)和‘品麗珠’(Cabernet Franc)綠枝條由山西省農業科學院果樹研究所提供。

供試藥劑:各種限制性內切酶、LATaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶和SYBR Premix Ex TaqTM購自寶生物工程有限公司。反轉錄酶SuperScript?Ⅲ購自Invitrogen公司。DNA膠回收試劑盒購于Qiagen。抗生素以及異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程有限公司。其他常規化學藥品均為分析純。

1.2 同源與進化分析

利用NCBI數據庫分別下載擬南芥Arabidopsisthaliana(NP_565094.1)、二穗短柄草Brachypodiumdistachyon(XP_003574495.1)、衣藻Chlamydomonasreinhardtii(XP_001699134.1)、大麥Hordeumvulgare(BAB62846.1)、苜蓿Medicagotruncatula(XP_003608928.1)、水稻Oryzasativa(NP_001061833.1)、毛楊Populustrichocarpa(XP_002322147.2)、高粱Sorghumbicolor(AGZ15751.1)、節節麥Aegilopstauschii(EMT10403.1)、團藻Volvoxcarteri(XP_002947147.1)、玉米Zeamays(NP_001157804.1)、華東葡萄Vitispseudoreticulata(AAZ79355.1)和釀酒葡萄Vitisvinifera(XP_002283132.1、XP_002263479.1、XP_002274863.1、CBI16844.3、CBI32134.3、XP_002273358.1、XP_002285866.1、XP_002273730.2、XP_002285466.1、XP_002265514.1、XP_002265402.1、XP_002265354.1、XP_002266390.1、XP_002266616.1、XP_002266379.1、XP_002278093.1、XP_002272544.1、XP_002281984.1、XP_002285286.1、XP_002279374.1、XP_002273569.1、XP_002282355.1、XP_002273256.1和XP_002277743.1)乙醛脫氫酶蛋白全長序列與VvALDH10A9進行比對,得到其同源結構域,運用 ClustalX進行比對,利用MEGA6軟件構建Neighbor-Joining系統進化樹。

1.3 葡萄組織RNA提取及cDNA第一鏈的合成

取一年生葡萄‘夏黑’開花期的莖、葉、花,以及組培苗的根,液氮凍存,放于-80℃冰箱中備用,用于基因組織特異性表達分析。參考úrbez-Torres等[20]和Yan等[6]測定葡萄潰瘍病菌致病力的方法,選用L.theobromae菌株CSS-01接種一年生葡萄‘梅鹿轍’和‘品麗珠’綠枝條,于0、2、4、6和12 h,取葡萄枝條表皮,液氮凍存后于-80℃冰箱中保存,用于分析基因的誘導表達。采用TRIzol法(Qiagen)提取各組織樣品總RNA,經DNaseⅠ消化處理后,采用SuperScript?Ⅲ反轉錄酶(Invitrogen)反轉錄得到第一鏈cDNA,-20℃保存,用于基因克隆與熒光定量分析。

1.4 表達分析

依據VvALDH10A9序列設計特異性引物(正向引物Primer F:5′-AGAGGTGTGA ACGTGTGTCA-3′和反向引物Primer R:5′-TACCAGCCCCATGGTTCATT-3′),以VvEF1α(正向引物為5′-GCGGGCAAGAGATACCTCAA-3′;反向引物為5′-TCAATCTGTCTAG GAAAGGAAG-3′)作為內參基因,進行熒光定量PCR分析。采用SYBR GreenⅠ熒光染料法,反應體系參照TaKaRa說明書。反應體系為:反轉錄產物0.5 μL,引物(0.5 μmol/L) 3.5 μL,2×SYBR Premix ExTaqⅡ (Tli RNaseH Plus) 7 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.3 μL,加水至總體積14 μL。PCR儀為ABI 7500。根據溶解曲線以及凝膠電泳確定PCR產物是否特異。每個反應得到相應的Ct值。每個樣品進行3個平行反應,取平均值后,用2-△Ct方法算出基因的相對表達水平。

1.5 原核表達載體的構建與鑒定

將連接產物轉化到BL21(DE3)中,涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養基上,37℃過夜培養。挑取單克隆菌落搖培,取菌液進行PCR擴增,經瓊脂糖凝膠電泳驗證判斷菌體是否含有重組質粒。重組質粒委托北京博邁德基因技術有限公司進行測序。

1.6 重組蛋白誘導表達及純化

1.6.1 蛋白誘導表達

取1 mL菌液轉接至100 mL LB(含100 mg/L Amp)液體培養基中,37℃ 180 r/min搖培至OD600為0.4～0.6;取1 mL菌液加入100 μL IPTG至其終濃度為0.1 mmol/L,16℃ 120 r/min誘導過夜,取1 mL誘導后的菌液,于4℃ 8 000 r/min離心10 min收集菌體,用PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4,pH=7.4)沖洗1次,加10 mL PDT(PBS,0.1%Triton X-100,1 mmol/L PMSF,1 mmol/L DTT,pH=7.4)將菌體懸浮,超聲波裂解細胞(功率250 W,工作時間10 s,間隔10 s,工作10次)。4℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清,沉淀用10 mL PDT懸浮。取上清及沉淀,與誘導前后總蛋白樣品一起進行SDS-PAGE電泳。

1.6.2 誘導蛋白的純化

取1 mL混勻的Ni-NTA瓊脂糖加入至Bio-Rad層析柱中,加入3倍體積的Binding buffer(50 mmol/L NaH2PO4, 0.3 mol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑,pH=8.0)洗滌5次;緩緩加入待純化的上清蛋白,4℃孵育30 min;加入3倍體積的Wash buffer (50 mmol/L NaH2PO4, 0.3 mol/L NaCl, 20 mmol/L 咪唑,pH=8.0)洗滌3次;最后用0.5 mL的Elution buffer (50 mmol/L NaH2PO4, 0.3 mol/L NaCl, 250 mmol/L咪唑,pH=8.0) 洗脫蛋白。

1.7 重組乙醛脫氫酶活性測定

參考劉峰等[24]提供的乙醛脫氫酶活性測定方法。將10 μg純化蛋白加入到含1.5 mmol/L NAD (Sigma), 100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 8.5)的反應液中,用ddH2O定容至100 μL;加入20 μg乙醛,用酶聯儀 (GE Versamax)測定460 nm處的吸光度,每隔20 s測定1次,持續2 min。以pET-32a空載體誘導表達的蛋白作為對照。

2 結果與分析

2.1 VvALDH10A9的序列分析及進化分析

以VvALDH10A9為候選基因,設計特異性引物,利用RT-PCR從葡萄‘品麗珠’莖組織中獲得該基因全長ORF(open reading frame)片段,經測序比對,與NCBI公布的XM_002283654.4 (accession number)序列完全一致。該基因位于葡萄第17號染色體上,共有15個外顯子(exon)和14個內含子(intron) (圖1),cDNA開放閱讀框為1 512 bp,堿基組成為A(25.3%)、T(27%)、C(27.5%)、G(20.2%)。編碼含503個氨基酸的多肽,屬于乙醛脫氫酶第10家族[19],負電荷殘基(Asp + Glu)有50個,正電荷殘基(Arg + Lys)有60個(圖2)。EditSeq軟件分析結果顯示,VvALDH10A9理論分子量為55 kD,理論等電點pI為5.5。系統進化樹分析表明,該基因編碼的蛋白與擬南芥AtALDH10A8 (NP_565094.1)蛋白的同源性較高、親緣關系最近(圖3),推測可能與該蛋白具有相似的功能。

圖1 VvALDH10A9結構圖Fig.1 Gene structure of VvALDH10A9

圖2 VvALDH10A9核酸序列及推測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of VvALDH10A9 and its deduced amino acid sequence

圖3 VvALDH10A9與其他植物ALDH蛋白的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis of VvALDH10A9 and ALDHs from other plants

2.2 VvALDH10A9的表達分析

為了研究VvALDH10A9基因在生物脅迫下的表達特征,利用Real-time PCR分析葡萄潰瘍病菌CSS-01接種后該基因的表達模式,結果表明,VvALDH10A9在抗病葡萄品種‘梅鹿轍’中的表達變化不明顯,而在感病葡萄品種‘品麗珠’的表達量隨著處理時間的延長而上升,并且在處理6 h時表達量迅速上升達到最大值,隨后表達量又呈現下降趨勢(圖4a),以上結果表明該基因對葡萄潰瘍病菌表現出一定的適應性,表達受到精細調控。

同時對該基因的組織表達特征進行了分析,結果顯示,VvALDH10A9 在葡萄的各個組織中均有表達,在莖、葉和花中表達量最高,而在根中表達量相對較低(圖4b)。

2.3 VvALDH10A9的原核表達

當將基因全長序列構建至pET-32a時,未誘導出目的蛋白;隨后將去除信號肽的VvALDH10A9基因序列(73 bp～1 509 bp)構建至pET-32a上,片段長度為1 437 bp,編碼479個氨基酸,經計算其分子量約為51.7 kD,而pET-32a編碼的蛋白為20.1 kD,因此推定該融合蛋白分子量約為71.8 kD。為了獲得能夠可溶性表達的目的蛋白,在16℃,用終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導過夜,誘導完成后進行SDS-PAGE電泳檢測。結果表明,超聲波破碎后沉淀中無明顯誘導條帶,而上清液在70 kD處有一蛋白質條帶,與重組質粒推測的表達蛋白大小相近(圖5)。為了進一步鑒定該蛋白,將誘導獲得的粗蛋白用Ni-NTA進行親和純化,以250 mmol/L咪唑將蛋白洗脫,SDS-PAGE電泳發現在70 kD左右有一條明顯的蛋白質條帶(圖5),其大小與推測的融合蛋白大小一致,測定濃度為0.9 mg/mL。

圖4 VvALDH10A9的表達分析Fig.4 Expression analysis of VvALDH10A9 in grapevine

圖5 VvALDH10A9基因重組蛋白在大腸桿菌的表達和純化Fig.5 Expression and purification analysis of recombinant VvALDH10A9/pET32a protein in Escherichia coli BL21

2.4 純化蛋白乙醛脫氫酶活性測定

為了確定VvALDH10A9蛋白是否編碼一個有功能的乙醛脫氫酶蛋白,對純化蛋白的體外活性進行測定。結果表明,在乙醛存在時,pET-32a測定值基本沒有發生變化,而ALDH10A9/pET-32a的測定值增加了2.5倍(圖6)。與此相反,對照pET-32a中僅檢測到背景。由此推斷,在NAD+的輔助下,VvALDH10A9蛋白可將底物乙醛分解,具有乙醛脫氫酶活性。

圖6 VvALDH10A9重組蛋白體外酶活性測定Fig.6 Aldehyde dehydrogenase activity assay of purified recombinant VvALDH10A9/pET32a protein

3 討論

醛脫氫酶是一類氧化各種內源性和外源性醛的酶類,在NAD(P)+的協助下,將醛氧化形成相對應的羧酸,從而保護植物不被醛類毒害。近幾年,關于ALDHs家族的研究已取得很大進展,然而,大多數的研究集中在植物的花器官發育過程,關于非生物脅迫過程中醛脫氫酶的研究也主要集中在擬南芥[16]、水稻[21]和玉米[22]等模式植物,而葡萄中關于該家族成員與植物抗病的研究報道相對較少。依托轉錄組分析數據,本研究采用RT-PCR技術克隆到編碼醛脫氫酶的VvALDH10A9基因。經測序發現,該基因片段為1 512 bp,能編碼含有503個氨基酸殘基的蛋白。通過氨基酸序列比對發現,VvALDH10A9蛋白與VvALDH10B1、擬南芥AtALDH10A8蛋白親緣關系最近(圖 3),推測可能與該分支蛋白具有相似的功能。

研究發現,醛脫氫酶除了具有催化醛類的作用之外,在植物的生長發育和逆境響應中具有重要的生理功能。水稻OsALDH7基因受氧脅迫和非生物脅迫強烈誘導,對水稻種子的成熟和種子的活性至關重要[23]。玉米rf2a基因編碼一個線粒體ALDH2B2基因,與玉米花粉發育有關,且在玉米功能性雄配子體產生過程中發揮重要作用[24]。有研究指出,ALDH3I1和ALDH7B4這兩個基因分別被脫水、高鹽和脫落酸(ABA)不同程度地在不同組織中特異激活,可顯著提高擬南芥對上述脅迫的抵抗能力[25]。玉米ZmALDH22A1基因在煙草中的過量表達可顯著提高轉基因植株對ABA、鹽、甘露醇和脫水等的抗脅迫能力[26]。脫水、高鹽、脫落酸和UV照射都可誘導念珠藻ALDH21A1基因的表達[27]。為揭示醛脫氫酶VvALDH10A9基因的相關功能,對該基因的組織特異性表達情況進行了研究。試驗結果顯示,該基因在葡萄葉片、莖和花中的表達量比較高,在根中的表達量最低,推測其可能參與葡萄花的發育等生理過程。此外,醛脫氫酶基因在植物應對病原菌脅迫上也發揮著重要的作用[18,28]。野生葡萄VpALDH2B4基因編碼蛋白定位于細胞線粒體,并受到病原菌Erysiphenecator和Plasmoparaviticola誘導表達。該基因在擬南芥中的過量表達可顯著提高植株對病原菌Hyaloperonosporaarabidopsidis和Golovinomycescichoracearum的抵抗能力[30]。本研究也發現,葡萄VvALDH10A9基因對葡萄潰瘍病菌的侵染有應答,推測該基因在葡萄潰瘍菌侵染初期發揮著一定的作用。VvALDH10A9基因如何行使功能目前還不清楚,因此本研究進一步構建原核表達 VvALDH10A9蛋白的載體,并誘導其在大腸桿菌中高量表達、純化獲得了 VvALDH10A9原核表達蛋白。本試驗選擇表達的蛋白是去掉信號肽,因為真核生物蛋白在原核系統中表達時,信號肽的存在很容易導致原核表達蛋白的失敗[25]。本研究表達獲得的純化蛋白表現出乙醛脫氫酶活性,這與此前關于這一酶類的報道相吻合,為其功能研究奠定了基礎。但關于其具體生物學功能,有待于獲得超表達和RNAi干擾轉基因植株后做進一步分析。

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(責任編輯： 田 喆)

Cloning,expressionandenzymeactivityanalysisofanaldehydedehydrogenasegeneVvALDH10A9ingrapevine

Xing Qikai, Yan Jiye, Zhang Wei, Liu Mei, Fu Chunyuan, Li Xinghong

(InstituteofPlantandEnvironmentalProtection,BeijingAcademyofAgriculturalandForestrySciences,Beijing100097,China)

Botryosphaeria dieback caused by pathogens of the fungal family Botryosphaeriaceae is currently one of the most important trunk diseases in the world’s primary grape production areas. This disease had seriously affected the grape yield and quality. Investigating the genes that play roles in grape-Botryosphaeriaceae interactions helps us understand the defense mechanism in grapevine. In this study, depending on the transcription analysis, an aldehyde dehydrogenase geneVvALDH10A9 was cloned using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) based on the transcriptome information. Phylogenetic analysis ofVvALDH10A9 and other 37 characterized ALDH proteins revealed that VvALDH10A9 was more closely related to AtALDH10A8. Quantitative real-time PCR assays showed thatVvALDH10A9 was preferentially expressed in leaf blades, stem and flower. Additionally,VvALDH10A9 was rapidly induced byLasiodiplodiatheobromaeCSS-01s in susceptible cultivar but not in resistant cultivar. Further analysis indicated that purified VvALDH10A9 protein showed enzyme activities to acetaldehydeinvitro.

grape; Botryosphaeria dieback; aldehyde dehydrogenase;VvALDH10A9; prokaryotic expression

研究報告ResearchReports

S 436.631

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.005

2016-10-31

： 2017-01-17

國家葡萄產業技術體系( CARS-30)；北京市博士后工作經費；北京市農林科學院博士后基金

* 通信作者 E-mail: lixinghong1962@163.com