關于制作小型動物透明骨骼標本方法的研究

張乘月

摘 要 小型動物透明骨骼標本是一種通過解剖學方法對動物體進行處理，并采用化學試劑使小動物肌肉變得透明，從而顯現出被染色的動物骨骼的標本。作者通過一系列實驗，摸索出制作透明骨骼標本的具體操作步驟，并從不同動物體的處理方式、制作過程中使用的化學試劑濃度、處理時間的調整、動物體差異等因素對于最終標本成品的影響進行了探討，該方法可操作性強，為需要制作此類標本者提供了實際經驗參考。

關鍵詞 透明標本；小型動物；骨骼；化學試劑法

中圖分類號 R3 文獻標識碼 A 文章編號 2095-6363（2017）17-0033-02

小型動物透明骨骼標本可以精確而直觀地向我們展示動物體的骨骼形狀和位置，猶如X光片一樣。而分別用兩種不同的染色劑進行浸泡的工藝，很自然地將硬骨和軟骨用不同的顏色進行區分，是比X光片更加直觀的展現方式。透明骨骼標本能為科學研究提供準確的骨骼結構，相比傳統的剝制骨骼標本，能更精確地展現動物硬骨和軟骨的原有位置。同時，制作得到的彩色標本非常具有美觀性，并具有一定的市場價值。目前，有關這類標本的制作方法的文獻較少，對于不同動物個體的實驗條件有很多不確定性，有待進一步摸索經驗和總結。筆者通過制作多批次金魚、熱帶魚、蛙和小鼠的標本，就各種因素對成品效果的影響進行了探討，并總結出一種制備步驟相對比較簡單、所需試劑較為易得、成品效果美觀的方法。

1 化學試劑

無水乙醇，重鉻酸鉀，1%～2%氫氧化鉀溶液，阿利新藍，茜素紅，冰醋酸，甘油，純凈水（去離子水或蒸餾水）。

2 制作步驟

1）對新鮮小動物尸體進行解剖學處理，將動物體剝皮，去除內臟及皮下脂肪，流水沖凈，浸入無水乙醇中一周，以使動物體硬化。

2）浸入重鉻酸鉀（0.1mol/L）等溶脂質性溶液中約48h，以去除脂肪，倒回無水乙醇中浸泡約24h。

3）配制阿利新藍在8倍體積的無水乙醇和2倍體積的冰醋酸中的飽和溶液，將動物體浸入其中約24h，從而為軟骨染色。

4）用純凈水浸泡，并不斷換液以去除殘留溶液。

5）浸入約1%～2%氫氧化鉀溶液中約4h～6h，以使肌肉呈半透明狀態。

6）配制茜素紅在無水乙醇中的飽和溶液，加入9倍體積的1%氫氧化鉀溶液，浸泡動物體約48h，從而為硬骨染色。

7）用純凈水浸泡，并不斷換液以去除殘留溶液，浸入3%過氧化氫溶液，從而進行脫色。

8）使用升序梯度濃度的甘油溶液進行脫色，最后將標本浸泡在純甘油中保存。

3 各種因素對骨骼標本制作的影響

3.1 解剖學處理方式對于骨骼標本成品效果的影響

對于一些體型較小（小于5cm）的魚類及幼體蛙類，剝皮是可選步驟，并且既可以在開始制作前進行，也可以在第5步預透明之后進行，這兩者間沒有過大的差異，但去除魚鱗是必要的。而對于體型較大的動物或有皮毛的動物（如成體小鼠），如果省略剝皮這一步驟，則會對最終的透明效果有較大影響。剝皮要盡量小心仔細，以減少對于肌肉和骨骼的損傷。

處理內臟的過程也與剝皮相似，只對于較大的動物體是必要的。這一步驟可以在第1步就進行，而對于熱帶魚等體型較小的動物，則可以在第5步后使用注射器抽出，因為此時肌肉和各類組織已經變得柔軟透明，比較容易進行加工。亦可以使用注射器吸取與第5步所使用的溶液相同濃度的氫氧化鉀溶液，不斷沖洗腹腔以去除內臟。

由于腦組織不能隨肌肉一起變得透明，會在制作完成后使頭部發黑，不能完全地顯示頭骨的形態，所以同樣需要特殊處理，可以在第5步浸泡完成后用小鑷子去除眼睛，將注射器伸進頭骨，用氫氧化鉀溶液不斷沖洗頭骨，以去除腦組織成分。

3.2 預透明步驟中氫氧化鉀溶液濃度對于骨骼標本成品效果的影響

預透明步驟，也就是第5步，是整體制作過程中對于成品影響最大、也最難控制的一步。

首先，氫氧化鉀溶液并不是一個標準的用量，需要根據動物體的大小和實際的操作情況進行調節，但這個濃度一般會掌握在1%～2%之間，浸泡時間長短也要根據實際情況隨時調節。例如，實驗證明，體長8cm的金魚需要在1%氫氧化鉀溶液中浸泡4h左右，而5cm左右的金魚只需要浸泡3h左右；幼體青蛙如果不事先剝皮并處理皮下組織，會比較難透明，因此需要在2%氫氧化鉀溶液中浸泡大約6h。

其次，對于溫度的控制也十分重要，室內溫度較高時可以相應的縮短這一步的時間，并保持標本體被置于陰涼處。非常重要的是，要時時觀察標本體的狀態，看到肌肉變得柔軟并呈半透明狀即可，過度進行此步驟可能導致在接下來的步驟中肌肉組織組織腐爛，不能支撐骨骼結構。另外，在此步驟以及后續步驟中，多個標本體可以在同一容器中進行制作，只要保證試劑沒過標本即可，這樣既可以節約時間又可以節約試劑成本。

3.3 兩種染色劑對于骨骼標本成品效果的影響

從原理上來講，阿利新藍與軟骨中的酸結合，而茜素紅與硬骨中的鈣結合，因此，并不是任何染色劑都能滿足骨骼標本制作的需求。另外，這兩種染色劑的使用也需要根據具體動物體的情況來決定。對于大多數動物，使用阿利新藍的染色過程是一個可選步驟，因為茜素紅已經能很好的顯示硬骨的結構。而對于一些特殊的標本體，例如硬骨沒有發育完全的幼體、以及鰩魚等以軟骨為主的動物，則應當使用阿利新藍染色，以展現出其軟骨組織的形態。

3.4 最終透明階段所采用的試劑及其濃度對于骨骼標本成品效果的影響

如制作方法中的第8步所述，最后的透明階段需要使用升序梯度濃度的甘油（丙三醇），詳細地說，第一梯度是使用4倍體積的1%氫氧化鈉溶液與1倍體積的甘油的混合溶液進行浸泡。在這一步驟中，理論上來講是時間越長越好，一般浸泡一周左右，因為隨著甘油浸入肌肉，肌肉組織會變得越來越透明。需要注意的是，千萬不要因為急于使肌肉變得透明而企圖加熱浸泡的溶液，這同樣適用于其他各個步驟，雖然加熱確實能使液體對流，更加迅速地完成制作，但這會對標本體造成很大傷害，導致肌肉不能很好的將骨骼連接在一起。

在使用上述溶液浸泡一周之后，依次遞階更換成40%、60%、80%和100%濃度的甘油。要注意的是，較高濃度的甘油十分粘稠，很難對流，所以需要不時輕輕地上下顛倒混勻，在溶液均勻后（大約每個梯度濃度浸泡2天），即可更換成下一濃度，直到更換為100%的純甘油。密封于玻璃瓶中，標本體可以在純甘油中長期

保存。

3.5 個體差異對于骨骼標本成品效果的分析

通過對多次實驗研究過程的觀察，筆者發現，動物體的個體差異對于成品的最終效果有著很大的影響。

例如，同品種的小鼠之間皮下脂肪含量有很大差異，如果不經處理，會導致皮下脂肪較多的小鼠出現肌肉部分渾濁，并伴有乳白色的脂肪塊，透明效果欠佳。此時就需要在剝皮時盡量去除皮下脂肪（又不能傷及肌肉和骨骼），或是使用溶脂性溶液（如重鉻酸鉀溶液等）進行浸泡。

再例如，同種熱帶魚雄魚和雌魚之間的差異也不容小視，對于雌魚腹內的魚卵需要在預處理階段用清水洗凈，否則腹部將成為半透明狀，影響透明效果。

4 成果

作者制作了多批次金魚、熱帶魚、青蛙幼體和小鼠的標本。這種標本的形式既能使動物體各個精細結構展露無遺，又能從多角度呈現立體的骨骼結構，方便觀察，避免了傳統的解剖取骨清洗再組裝而導致的骨骼相對位置的改變。所制作的部分標本成品展示如下圖所示。

5 結論

實驗證明，對小動物體的處理方式、各個階段所采用的試劑的濃度大小、浸漬時間長短、動物個體差異等因素都會對骨骼標本的成品效果會產生影響，甚至會使得制作批次的產品完全失敗。制作透明骨骼標本的過程中不定因素非常多，需要我們細心觀察制作過程中動物體的變化，及時調整實驗條件，多次實驗，總結經驗、不斷摸索恰當的實驗條件。

參考文獻

[1]李典友，高本剛.生物標本采集與制作[M].北京：化學工業出版社，2016：88-105.endprint