海島棉苗期鹽脅迫下形態學和生理學指標變化

趙海燕，王建設，劉林強，陳勇全，李夢飛，盧全偉，劉方，彭仁海

（1安陽工學院生物與食品工程學院，河南安陽455000；2中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

海島棉苗期鹽脅迫下形態學和生理學指標變化

趙海燕1,2，王建設1，劉林強1，陳勇全1，李夢飛1，盧全偉1，劉方2，彭仁海1

（1安陽工學院生物與食品工程學院，河南安陽455000；2中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

【目的】在300 mmol·L-1NaCl 脅迫下，觀察并測定海島棉耐鹽性強的品系越海9號和耐鹽性弱的品系PS-7葉片、莖細胞解剖結構和生理學指標，從形態學和生理學兩個水平研究海島棉苗期響應鹽脅迫的應答機制，為棉花耐鹽材料的篩選提供理論依據和技術方案。【方法】采用水培方法，待棉苗生長至3葉期時，開始進行300 mmol·L-1NaCl脅迫處理。運用光學顯微技術及生理學指標測定法，在不同NaCl脅迫處理時間下，對海島棉耐鹽性強的品系越海9號和耐鹽性弱的品系PS-7進行形態學觀察及生理學指標分析。【結果】2份海島棉材料對 NaCl 脅迫的反應不同。隨著300 mmol·L-1NaCl處理時間的延長，與對照相比，越海9號和PS-7的葉片和莖的橫切面面積均顯著變小，處理24 h時，分別變小14.10%、54.69%與45.30%、87.90%，PS-7的變化幅度大于越海9號；處理12 h時，PS-7維管束中木質部已經損害嚴重，越海9號維管束中木質部則沒有明顯變化；PS-7的柵欄組織細胞在處理24 h時由長圓柱形變為卵圓形，越海9號的柵欄組織細胞的形狀則沒有變化。生理學研究表明，越海9號葉片中的葉綠素含量、超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性在整個處理過程中均高于PS-7，而其丙二醛含量卻明顯低于PS-7；在300 mmol·L-1NaCl處理8 h時，越海9號和PS-7中的丙二醛含量、葉綠素含量、超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性均達到了顯著性差異。【結論】葉片中柵欄組織和莖中木質部可能是海島棉響應鹽脅迫的最敏感部分，葉綠素、丙二醛、超氧化物歧化酶和過氧化物酶可作為鑒定耐鹽棉花材料的生理學指標。

海島棉；苗期；鹽脅迫；形態學；生理學

Abstract:【Objective】The changes of cell structures and physiological characteristics in leaves and stems of two Gossypium barbadense varieties, Yuehai 9 (salt tolerance) and PS-7 (salt sensitive), were investigated under different salt stress conditions.Morphological and physiological mechanism of salt tolerance in Gossypium barbadense to salt stress at seedling stage was studied to offer a theoretical basis and technical reference for selecting salt-tolerant genes in cotton cultivars. 【Method】In a water culture experiment, three-leaf cotton seedlings were treated with NaCl at 300 mmol·L-1NaCl for different times. This study involved observation of morphological features and comparison of physiological indexes of two Gossypium barbadense, Yuehai 9 (salt tolerance) and PS-7 (salt sensitive) under different salt stress treatments by means of optical microscopy and measurement ofphysiological indices.【Result】There was a difference in effect on two cotton cultivars by salt stress. At 300 mmol·L-1of NaCl, with the prolongation of treatment period, the transections of the leaves and stems of Yuehai 9 and PS-7 were both significantly smaller compared with the control groups, decreased, respectively, by 14.10%, 54.69% and 45.30%, 87.90% at 300 mmol·L-1of NaCl after 24 h, and the variation range of PS-7 was larger than that of Yuehai 9. The xylem of the vascular bundle of PS-7 was severely damaged while the xylem of the vascular bundle of Yuehai 9 showed no significant change in 300 mmol·L-1of NaCl treatment for 12 h. The long cylindrical palisade tissue cell of PS-7 became smaller and ovoid in 300 mmol·L-1of NaCl treatment after 24 h while the shape of the palisade tissue cell of Yuehai 9 showed no change. The chlorophyll contents, superoxide dismutase and peroxidase activities in leaves of Yuehai 9 were significantly higher than those of PS-7, while its malondialdehyde contents was lower than that of PS-7. Yuehai 9 and PS-7 were different in chlorophyll contents, malondialdehyde contents, superoxide dismutase and peroxidase activities, and the differences reached a significant level at 300 mmol·L-1of NaCl after 8 h. 【Conclusion】 The most sensitive plant part to salt stress may be the palisade tissues of leaves and xylem in the stem. The chlorophyll, malondialdehyde, superoxide dismutase and peroxidase can be used as the physiological indexes for evaluating and selecting salt tolerance cotton materials.

Key words:Gossypium barbadense L.; seedling; salt stress; morphological index; physiological index

0 引言

【研究意義】土壤鹽漬化是一個世界性的資源問題和環境問題，是農業生產主要的限制條件之一[1]。中國鹽堿化耕地面積約3 467萬hm2（5.2億畝），在世界上居第四位。其中，新疆的鹽堿化土地約占中國鹽堿地總面積的1/3。改良和利用這些鹽堿土地，可擴大有效的耕地面積，對于中國農業的可持續發展具有重要意義[2-3]。作為鹽堿地的先鋒作物，棉花不僅具有耐鹽堿、耐瘠薄的能力，還具有改良鹽堿地的能力。如在中國北方山東東營和河北滄州等鹽堿地區，約有40萬hm2土地，由于土壤鹽堿化程度較高，不適于種植糧食作物，如果用于棉花生產，經過5—10年改良，可逐步發展小麥、玉米等糧食生產[2]。因此，開展棉花耐鹽機理研究，挖掘棉花耐鹽遺傳資源，對培育耐鹽作物品種，擴大可利用耕地面積，恢復生態環境，保證農業可持續發展具有深遠意義。【前人研究進展】關于棉花的耐鹽機制，研究者從棉株體內的離子平衡[4]、滲透調節[5]、活性氧清除[5]、耐鹽相關基因克隆及轉化[6]、蛋白質組學[7]、甲基化[8]、單核苷酸多態性[9]、簡單重復序列標記鑒定[10]等方面進行了研究，取得了一定進展。當前研究對象多為陸地棉，迄今對海島棉耐鹽性及其機理的研究較少。海島棉最初發現于美洲大西洋沿岸群島，其品質優于陸地棉，纖維長、細度高、強度大、抗性強，是紡制高檔和特種棉紡織品的重要原料[11]。劉國強等[12]對棉花4個栽培種4 078份品種資源進行了耐鹽性鑒定，結果表明非洲棉高耐鹽和耐鹽的材料有4個；海島棉高耐及耐鹽的材料有12個；陸地棉中耐鹽材料只有3個，沒有高耐鹽材料；亞洲棉中沒有高耐及耐鹽品種。【本研究切入點】從以上分析可看出海島棉的耐鹽性比較突出。而鹽脅迫對海島棉葉、莖等組織解剖結構的影響研究尚未見報道。為此，本試驗以人工培養室中水培的海島棉為材料，從解剖結構及生理指標特征入手，探究不同鹽脅迫處理時間對耐鹽性不同的海島棉形態學和生理學的影響。【擬解決的關鍵問題】以海島棉耐鹽性強的品系越海9號和耐鹽性弱的品系PS-7為試驗材料，進行不同時間鹽脅迫處理，觀察對照與處理組莖、葉的顯微結構，分析不同鹽脅迫時間處理下葉片生理學指標變化，以期明確不同耐鹽海島棉材料細胞結構和生理學指標對鹽脅迫的響應，進而探討它們之間的關系。本研究從形態學和生理學角度闡明其耐鹽機制，旨在豐富海島棉耐鹽脅迫逆境理論，為海島棉耐鹽材料篩選提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為海島棉耐鹽性強的品系越海9號和耐鹽性弱的品系PS-7。越海9號由中國農業科學院棉花研究所王坤波研究員于2002年從越南引進，PS-7為2007年從美國棉花種質庫引進，2份材料都已經過多代自交和耐鹽性鑒定（圖1）。

1.2 試驗方法

2016年3 月，在中國農業科學院棉花研究所將兩份供試材料經濃硫酸脫絨、洗凈、晾干后，選擇籽粒飽滿一致的種子用20%雙氧水消毒并用蒸餾水沖洗干凈，參照王俊娟等[13]的方法進行雙夾層濾紙發芽試驗。將發芽后的種子用簿的海綿條裹住胚根并插入帶孔泡沫懸浮板中，放入裝6 L去離子水配制的Hoagland營養液的培養盆中，每盆12株。將培養盆移入培養室進行培養，培養條件設置為：晝夜溫度28℃/23℃，相對濕度 65%—70%，光照強度 400 μmol·m-2·s-1，光周期14 h/10 h（晝/夜）。培養期間，使用電動氣泵為培養液持續通入氧氣，每3 d換一次營養液。待棉苗生長至3葉期時，開始對棉株進行鹽脅迫處理。處理組NaCl的濃度為 300 mmol·L-1，對照組 NaCl的濃度為 0，分別采集鹽處理組4、8、12、24 h及對照組的莖和葉片，進行相應試驗。

圖1 越海9號（A）和PS-7（B）發芽期耐鹽性評價Fig. 1 The appraisal of the salt tolerance between Yuehai 9 (A) and PS-7 (B) in germination phase

1.2.1 形態學觀察 將采集的鹽處理與對照組的葉片和莖分別放入FAA固定液中抽氣并固定，24 h后轉入 70%乙醇中低溫（4℃）保存。材料經各級乙醇脫水、石蠟包埋和切片（蠟帶厚度為8 μm）后，用番紅-固綠染色液染片，中性樹膠封片，制成永久片，在Motic AE31生物顯微鏡下觀察不同處理的葉片和莖的細胞形態特征并拍照。所拍照片采用Motic Images Plus 2.0ML圖像分析系統進行測量。

1.2.2 生理指標測定 采用SPAD-502Plus便攜式葉綠素儀，分別測定不同鹽處理組及對照組棉株最大功能葉的葉綠素含量。將采集的不同鹽處理與對照組的葉片稱重、分裝，采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛的含量[14]。采用氮藍四唑光還原法測定超氧化物歧化酶活性[15]。采用愈創木酚-過氧化氫法測定過氧化物酶活性[15]。

2 結果

2.1 鹽脅迫對海島棉葉片組織顯微結構影響

對海島棉耐鹽性強的品系越海9號和耐鹽性弱的品系 PS-7在不同鹽脅迫處理下葉片的石蠟切片進行觀察，結果如下：

對照組：即正常無鹽脅迫。從橫切面上看，越海9號和PS-7葉片均為異面葉，由上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮 4部分組成（圖 2-Y1，P1）。其中，越海9號上下表皮均由單層不規則四邊形細胞緊密排列而成，柵欄組織在上表皮下方，呈長柱狀，排列較整齊、緊湊，細胞內含較多葉綠體，細胞染色較深；海綿組織在柵欄組織與下表皮之間，多呈橢圓形，排列松散；柵欄組織與海綿組織之間分布有葉脈組織細胞（圖 2-Y1）。PS-7上下表皮也均由單層不規則四邊形細胞緊密排列而成；柵欄組織細胞特征與越海 9號的相似，但排列比越海9號的疏松；海綿組織細胞多呈桿狀，排列也較松散；柵欄組織與海綿組織之間也分布有葉脈組織細胞（圖 2-P1）。從表 1可看出，PS-7的上表皮、下表皮、柵欄組織、海綿組織和葉片橫切面的厚度及柵欄組織/海綿組織的比值均小于越海9號。

300 mmol·L-1NaCl處理4 h：越海9號上下表皮、柵欄組織細胞特征與排列變化不明顯；海綿組織細胞呈卵圓形，排列稍緊密；海綿組織、葉片橫切面的厚度比對照分別變薄23.3%和13.9%（圖2-Y2，表1）。PS-7上表皮細胞排列整齊；柵欄組織細胞數目增多、排列緊密；海綿組織細胞也呈卵圓形，排列稍緊密；海綿組織、葉片橫切面的厚度比對照分別變薄18%和8.4%（圖2-P2，表1）。

300 mmol·L-1NaCl處理8 h：越海9號上下表皮、柵欄組織的細胞排列無明顯變化；海綿組織細胞變小，數目增多，排列較緊密；上表皮、下表皮、柵欄組織、海綿組織和葉片橫切面的厚度比300 mmol·L-1NaCl處理4 h時顯著變小，分別變小55.4%、45.1%、55.4%、55.2%和 54.5%，柵欄組織/海綿組織的比值變化不明顯（圖2-Y3，表1）。PS-7上表皮、下表皮細胞厚度分別變小0.6%、18.2%；柵欄組織細胞變厚 15.9%；海綿組織細胞厚度變小1.4%，形狀不規則，排列較緊密；葉片橫切面的厚度變小 3.8%，柵欄組織/海綿組織的比值增大16%（圖2-P3，表1）。

圖2 不同鹽脅迫下越海9號和PS-7的葉片顯微結構Fig. 2 The microstructure of the leaves of Yuehai 9 and PS-7 under different NaCl treatments

300 mmol·L-1NaCl處理 12 h：越海 9 號及 PS-7 上下表皮、柵欄組織細胞排列均變化不明顯，海綿組織細胞排列更加緊密（圖2-Y4，圖2-P4）。越海9號的上表皮、下表皮和海綿組織細胞厚度的降幅分別為0.8%、1.1%、6.7%；柵欄組織、葉片橫切面厚度及柵欄組織/海綿組織的比值分別增大9.3%、3.3%、15.7%（圖2-Y4，表1）。PS-7上表皮、下表皮、柵欄組織、海綿組織和葉片橫切面的厚度分別減小 57.3%、45.7%、56.5%、61.2%和 57.6%，柵欄組織/海綿組織的比值增大10.7%（圖2-P4，表1）。

300 mmol·L-1NaCl處理24 h：越海9號上下表皮、柵欄組織細胞排列無明顯變化，它們的厚度顯著增加，分別增加87.8%、99.5%、80.7%；海綿組織細胞排列稍松散，其厚度增加了1.3倍；葉片橫切面的厚度增加了1.1倍；柵欄組織/海綿組織的比值下降了20.3%（圖2-Y5，表1）。PS-7上表皮、下表皮細胞的厚度分別增大77.9%、13.7%；柵欄組織與海綿組織均變為不易區分的小卵圓形細胞，松散排列在上下表皮細胞間，海綿組織細胞的厚度增加了 61.4%；葉片橫切面的厚度增加了21.1%（圖2-P5，表1）。越海9號上下表皮、海綿組織、葉片橫切面厚度的增加幅度大于PS-7。

2.2 鹽脅迫對海島棉幼莖組織顯微結構影響

對海島棉耐鹽性強的品系越海9號和耐鹽性弱的品系 PS-7在不同鹽脅迫處理下莖的石蠟切片進行觀察，結果如下：

對照組即正常無鹽脅迫時，越海9號和PS-7莖的橫切面呈卵圓形，從外到內分別由表皮、皮層、維管束、髓射線和髓5部分組成。表皮由單層排列整齊的矩形細胞組成，細胞較小，細胞外壁分布著稀疏表皮毛。皮層由厚壁細胞和薄壁細胞組成，靠近表皮的幾層細胞比較小，染色比較深，為厚壁細胞。厚壁細胞內側為數層薄壁細胞，這些細胞體積較大，排列緊密。皮層內部為維管束，不等距排列成環形，包圍著髓。在維管束中，靠近皮層的一側為韌皮部，細胞較小，染色較深，靠近髓側的為木質部，由細胞壁加厚的 2—5列導管分子組成，韌皮部和木質部之間的部分為形成層，細胞小，壁薄，染色淺。位于莖中央的髓由體積較大、壁薄的細胞組成。兩個維管束之間的薄壁細胞群為髓射線，髓射線在靠近皮層一端的細胞較小，靠近髓一端細胞較大。越海9號和PS-7莖的橫切面無明顯差別（圖3-1，6）。

表1 不同鹽脅迫下越海9號和PS-7葉片解剖結構變化Table 1 Changes of anatomical structure of the leaves of Yuehai 9 and PS-7 under different NaCl treatments (mean ± SD, n =10)

隨著NaCl處理時間的延長，越海9號和PS-7莖內部結構也發生了相應的變化，呈現出一定的規律性，主要變化特征為：

（1）莖的橫切面面積逐步縮小，與對照相比，在NaCl處理24 h，越海9號和PS-7莖橫切面面積分別縮小 45.3%、87.9%，越海 9號橫切面面積是PS-7的4.3倍。莖橫切面橫向直徑的收縮程度大于縱向，PS-7橫切面在NaCl處理4 h由卵圓形變為橢圓形，而越海9號橫切面由卵圓形變為橢圓形則出現在NaCl處理8 h，PS-7橫切面橫向直徑的收縮速度大于越海9號。

（2）莖的表皮細胞壁染色逐漸加深，表皮厚度逐步減小，與對照相比，在NaCl處理24 h，越海9號和PS-7莖表皮厚度分別減小29.5%、65.7%，越海9號表皮厚度是PS-7的2.3倍。

（3）莖的皮層細胞在整個橫切面分布逐漸不對稱，皮層細胞厚度逐步減小，與對照相比，在 NaCl處理24 h，越海 9號和 PS-7的莖皮層細胞厚度分別減小30%、70.9%，越海9號的莖皮層細胞厚度是PS-7的2.3倍。

（4）維管束逐步變小，與對照相比，在 NaCl處理24 h，越海9號和PS-7維管束的長和寬分別減小30.1%和22.1%、69.8%和71.7%，越海9號維管束長和寬分別為PS-7維管束長和寬的2.3倍和2.7倍。在NaCl處理12 h時，PS-7木質部開始損害嚴重，越海9號木質部則沒有明顯變化。

（5）兩維管束間橫向髓射線細胞數量逐漸減少，與對照相比，在NaCl處理24 h，越海9號和PS-7橫向髓射線平均厚度分別減小 55.6%和 89.5%，越海 9號橫向髓射線平均厚度為PS-7的3.6倍。

（6）髓腔面積逐步減小，與對照相比，在 NaCl處理24 h，越海9號和PS-7髓腔的長和寬分別減小44%和41.2%、76.8%和74.5%，越海9號髓腔的長和寬分別為PS-7髓腔的長和寬的2.4倍和2.37倍（圖3，表2）。

圖3 不同鹽脅迫下越海9號和PS-7的莖顯微結構Fig. 3 The microstructure of the stems of Yuehai 9 and PS-7 under different NaCl treatment

表2 不同鹽脅迫下越海9號和PS-7莖解剖結構變化Table 2 Changes of anatomical structure of the stem of Yuehai 9(YH9) and PS-7 under different NaCl treatments (n =10)

2.3 鹽脅迫下不同海島棉葉片組織的生理生化指標變化

鹽脅迫導致植物細胞內離子不平衡，引起離子毒害、滲透壓力和活性氧的產生，從而影響植物的生長、形態和生存[16]。本研究對海島棉耐鹽性強的品系越海9號和耐鹽性弱的品系PS-7在不同鹽脅迫處理下的葉片進行了葉綠素含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的測定，結果如下：

從圖4-A中可以看出，隨著300 mmol·L-1NaCl脅迫時間延長，耐鹽性強的品系越海9號葉片中丙二醛含量呈現先升高后降低的趨勢，在NaCl脅迫12 h達最大值，整個過程變化幅度不大。耐鹽性弱的品系PS-7葉片中丙二醛含量隨著NaCl脅迫時間延長呈上升趨勢，在NaCl脅迫24 h達最大值。

圖4 鹽脅迫對不同海島棉生理指標的影響Fig. 4 Effect of salt stress on physiological indexes of leaves of different sea island cotton

從圖4-B中可以看出，耐鹽性弱的品系PS-7葉片中葉綠素含量在300 mmol·L-1NaCl脅迫不同時間下均低于耐鹽性強的品系越海9號。其中越海9號葉片中葉綠素含量隨著 NaCl脅迫時間延長呈現低-高-低-高的趨勢，NaCl處理組中葉綠素含量低于對照組。PS-7葉片中葉綠素含量隨著NaCl脅迫時間延長呈現高-低-高的趨勢，且NaCl脅迫24 h時的葉綠素含量略高于對照組。

從圖4-C中可以看出，耐鹽性強的品系越海9號葉片中超氧化物歧化酶活性隨300 mmol·L-1NaCl脅迫時間延長呈先升高后降低的趨勢，在NaCl脅迫12 h上升至最大值。但耐鹽性弱的品系PS-7葉片中超氧化物歧化酶活性則為先降低后升高的趨勢，在 300 mmol·L-1NaCl脅迫12 h降到了最低。PS-7葉片中超氧化物歧化酶活性在 NaCl脅迫不同時間下均低于越海9號。

從圖4-D中可以看出，隨著NaCl脅迫時間延長，耐鹽性強的品系越海9號葉片中過氧化物酶活性總體呈先升高后降低的趨勢，在NaCl脅迫12 h達到最大值。耐鹽性弱的品系PS-7葉片中過氧化物酶活性則呈降低的趨勢，在NaCl脅迫24 h降到最低。

3 討論

3.1 鹽脅迫對海島棉葉片解剖結構的影響

葉片是植物在進化過程中對環境變化較敏感且可塑性較強的器官，在不同的選擇壓力下會形成不同的適應類型，不同適應類型的結構特征能體現植物受環境因子的影響或對環境的適應[17]。鹽脅迫下，植物葉片內部解剖結構會發生顯著的變化，從而反映植物對鹽脅迫的響應程度。田晨霞等[18]研究發現，隨著鹽濃度的增加，紫花苜蓿葉片整體變薄，對海綿組織的影響大于柵欄組織；李學孚等[19]研究認為葡萄在鹽脅迫下表皮層、柵欄組織、海綿組織變厚，海綿組織和柵欄組織細胞間隙變大。本研究中，鹽脅迫下海島棉葉片各組成部分均顯著變薄（表 1），這與田晨霞等[18]的研究結果一致。在相同濃度、相同時間鹽脅迫條件下，對鹽敏感度不同海島棉品系葉片內部顯微結構對鹽脅迫的響應不同。在300 mmol·L-1NaCl處理24 h，越海9號柵欄組織細胞呈長柱形，PS-7柵欄組織由長柱形變為與海綿組織無明顯區分的小卵圓形或不規則形（圖 2），這與王秀麗等[20]對鹽脅迫下銀葉樹幼苗葉片解剖特征研究結果一致，也與曹享云等[21]、王秀榮等[22]研究營養缺乏時作物的解剖結構結果相似。在NaCl脅迫下，越海9號和PS-7葉片各組成細胞失水收縮，導致越海9號和PS-7葉片橫切面厚度變薄，PS-7對鹽敏感度可能大于越海9號，使PS-7葉脈結構受破壞的程度大于越海9號，對其正常的水分及營養物質運輸的影響也大于越海9號，進而對PS-7柵欄組織等細胞形態的影響也大于越海9號。

3.2 鹽脅迫對海島棉莖解剖結構的影響

莖將根部吸收的水分和礦物質通過木質部向上運輸到各營養器官，同時將葉片光合作用的產物通過韌皮部向下運輸，并把葉產生的有機物質運送到根內或暫存莖內[23]。田晨霞等[18]通過對不同濃度NaCl處理紫花苜蓿莖的細胞結構研究發現，隨著鹽濃度的增加，紫花苜蓿莖中的髓腔面積顯著減小。李斌等[24]的研究發現，黃瓜莖中維管束總面積在鹽脅迫下顯著降低，同時導管數量明顯變小、減少。本研究發現，隨著鹽脅迫時間延長，越海9號和PS-7莖內部的維管束總面積逐步變小，髓腔面積也逐步變小（表2），這與李斌等[24]、田晨霞等[18]的研究結果相似，這可能是植物莖應對鹽脅迫的指示特征，這種變化增加了水分從根系向葉片流動的阻力[25]，降低了維管組織的運輸能力，極大地限制了由根系吸收的溶解有鹽離子的水分向地上部分的運輸[26]。在相同鹽脅迫條件下，對鹽敏感度不同海島棉品系莖內部顯微結構對鹽脅迫的響應不同，PS-7維管束中木質部已經損害嚴重，越海9號維管束中木質部則無明顯損害現象（圖3）。根據GUO等[27]提出闡述質膜Na+/H+逆向轉運蛋白（SOSI）與高親和性K+轉運蛋白（HKT）協同作用模型，在NaCl處理12 h，PS-7對鹽敏感度可能大于越海9號，越海9號葉片中Na+積累量可能低于液泡區域化 Na+的能力，SOSI從木質部薄壁細胞將Na+裝載進木質部導管能力超過HKT介導的Na+從木質部導管卸載入木質部薄壁細胞的能力，導致 Na+能正常裝載進木質部導管的蒸騰流中運至植物的地上部分；PS-7葉片中液泡存儲Na+的能力可能已達飽和，HKT介導的 Na+從木質部卸載旳能力超過由SOSI介導的Na+向木質部導管的裝載，從而導致Na+從木質部導管卸載至木質部薄壁細胞，Na+在木質部薄壁細胞的過量積累就造成木質部的損害，從而抑制Na+等離子向地上部的運輸。

3.3 海島棉鹽脅迫下葉片生化指標變化與耐鹽性的關系

葉綠素是一類與光合作用有關的重要色素。在鹽脅迫下，葉片中葉綠素含量的變化不僅是導致光合作用受到抑制的重要原因之一，而且是反映植物受鹽脅迫傷害程度高低的重要指標之一。關于葉綠素含量與鹽脅迫的關系，目前存在2種不同觀點，一部分研究者認為鹽脅迫提高了葉綠素酶的活性，促使葉綠素降解或遭到破壞，導致葉綠素含量減少[28]；另外一觀點認為，低鈉鹽可以增加植物體內葉綠素含量[29]。本研究發現，隨著NaCl脅迫時間延長，耐鹽性強的品系越海9號與耐鹽性弱的品系PS-7葉片中葉綠素含量均呈現出先降低后升高的變化（圖4），這說明越海9號與PS-7可通過調節葉片中葉綠素的含量來抵御NaCl脅迫的傷害。此外，在整個實驗過程中，耐鹽性強的品系中的葉綠素含量均大于耐鹽性弱的品系，在鹽脅迫8 h兩者之間的差異最大（圖4），這說明相同鹽脅迫條件可能導致耐鹽性強的品系的光合作用效率比耐鹽性弱的品系更大一些，8 h可為后續的轉錄組、蛋白質組等研究提供材料處理時間的篩選依據。

植物在逆境條件下，通常發生膜脂過氧化作用，作為膜脂過氧化作用的分解產物，丙二醛含量的高低在一定程度上可以表示細胞膜脂過氧化的程度和植物對逆境條件反應的強弱[30]。在鹽脅迫下，丙二醛含量的高低在一定程度上可以作為評價植物耐鹽性低高的生理指標[31]。本研究發現，隨著300 mmol·L-1NaCl脅迫時間延長，耐鹽性強的品系越海9號葉片中丙二醛含量總體呈降低趨勢，耐鹽性弱的品系PS-7葉片中丙二醛含量則呈上升趨勢（圖 4），這與汪保華等[32]、ZHANG等[5]的研究結果相似。這說明在鹽脅迫過程中，耐鹽性強的品系越海9號能通過啟用細胞內各種保護機制有效地減輕膜脂質過氧化的誘導，從而減少丙二醛的產生；耐鹽性弱的品系PS-7則對鹽脅迫反應比較敏感，產生了較多的超氧自由基，誘導膜脂質過氧化，從而使植物體內產生了更多的丙二醛。此外，耐鹽性強的品系與耐鹽性弱的品系中的丙二醛含量在鹽脅迫24 h差異最大（圖4），這說明相同鹽脅迫條件可能導致耐鹽性強的品系中的細胞膜脂過氧化的程度低于耐鹽性弱的品系，24 h可為后續的轉錄組、蛋白質組等研究提供材料處理時間的篩選依據。

超氧化物歧化酶和過氧化物酶是植物體內活性氧清除系統的重要保護酶。當植物受到一定范圍的逆境脅迫時，體內會產生大量的活性氧，誘導超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗氧化酶活性水平升高和協同作用，清除體內過量的活性氧，防止膜脂過氧化，使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境脅迫的傷害[33]。然而，逆境脅迫一旦超過植物所承受范圍，超氧化物歧化酶、過氧化物酶等抗氧化酶則無法清除體內多余的活性氧，打破了活性氧代謝平衡，最終會嚴重影響植物生長。

超氧化物歧化酶能催化過氧陰離子發生歧化反應，生成過氧化氫，是植物體內防御和抵抗活性氧毒害的第一道防線[34]。過氧化氫仍然是活性氧存在的一種形式，過氧化物酶等抗氧化酶分別通過不同的反應途徑將過氧化氫轉化為水和氧氣，從而提高植物對逆境的耐受能力[35]。本研究發現，隨著300 mmol·L-1NaCl脅迫時間延長，耐鹽性強的品系越海9號葉片中超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性均呈先升高后降低趨勢，耐鹽性弱的品系PS-7葉片中超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性則呈降低趨勢（圖4），這與楊淑萍[36]、史華平等[37]的研究結果相似。這說明在鹽脅迫過程中，耐鹽性強的品系越海9號能通過提高超氧化物歧化酶和過氧化物的酶活性來清除體內多余的活性氧，以抵御鹽脅迫傷害；耐鹽性弱的品系PS-7葉片中超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性卻受到抑制，引起膜脂質過氧化，影響了棉花的生長。此外，耐鹽性強的品系與耐鹽性弱的品系中的超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性分別在鹽脅迫12 h、24 h差異最大（圖4），這與材料的鹽敏感性及超氧化物歧化酶和過氧化物酶清除活性氧的反應原理不同相關，12 h、24 h可為后續的轉錄組、蛋白質組等研究提供材料處理時間的篩選依據。

3.4 海島棉鹽脅迫下形態學研究與生理學研究的一致性和互補性

3.4.1 形態學研究與生理學研究具有一致性 鹽分不僅改變植物的代謝機制，而且影響植物的正常生長，尤其是植物的形態學和解剖學[38]，植物在鹽脅迫下所表現出的細胞形態和生理學指標變化能反映出該植物對鹽的敏感性。

形態學研究發現，在鹽脅迫下，PS-7和越海9號的葉片和莖的橫切面面積均顯著變小，PS-7的變化幅度大于越海9號，PS-7莖中木質部、葉中柵欄組織細胞分別在NaCl處理12 h、24 h出現損害，并呈現由長圓柱形變為卵圓形的形狀變化，越海9號的相應組織在相應脅迫時間下則無明顯變化（圖2—3），這說明在相同鹽脅迫條件下，PS-7受鹽脅迫的傷害大于越海9號，越海9號的耐鹽性大于PS-7。生理學研究發現，越海9號葉片中的葉綠素含量、超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性在 NaCl處理過程中均顯著高于PS-7，而其丙二醛含量卻明顯低于PS-7（圖4），這表明在相同鹽脅迫條件下，與PS-7相比，越海9號葉片中具有較高的光合效率、活性氧清除酶活性及較低的膜脂過氧化，越海9號的耐鹽性大于PS-7，與形態學研究結果一致。可見，形態學研究與生理學研究在鑒定材料的鹽敏感性方面具有一致性。

3.4.2 形態學研究與生理學研究具有互補性 植物的耐鹽機理是非常復雜的，鹽脅迫不僅影響植物的生理和代謝過程，而且引起植物形態、解剖結構等多方面的變化[39]，這些多方面變化之間的綜合分析在耐鹽機理的解析上具有互補性。

NaCl處理12 h，PS-7莖中木質部出現損害，此時葉內超氧化物歧化酶的活性降到整個鹽脅迫過程中最低點，隨后在NaCl處理24 h，其葉內柵欄組織細胞由長圓柱形變為卵圓形，這時葉內過氧化物酶的活性降到整個鹽脅迫過程中最低，丙二醛的含量卻上升到整個鹽脅迫過程中最高點（圖2—4）。這些現象產生的可能原因：在鹽脅迫初期，PS-7莖中木質部在質膜Na+/H+逆向轉運蛋白（SOSI）作用下，將根從溶液中吸收的 Na+向葉片中運輸。隨著鹽脅迫時間延長，當葉片細胞中存儲 Na+的能力達到飽和時，高親和性K+轉運蛋白（HKT）介導Na+從木質部導管卸載至木質部薄壁細胞，Na+在木質部薄壁細胞的過量積累就造成木質部的損害，從而抑制水、無機鹽等離子向地上部運輸。葉片一旦缺少水、無機鹽等離子就打破了細胞內活性氧代謝平衡，造成超氧化物歧化酶、過氧化物酶等活性氧清除系統酶活性下降，引起柵欄組織細胞形狀改變。以上推測雖然有待進一步進行試驗證明，但不同水平試驗現象和數據的綜合分析為耐鹽機理的解析提供依據。

4 結論

越海9號和PS-7的莖、葉內部結構在300 mmol·L-1NaCl脅迫4 h的過程中差異不大，隨著NaCl脅迫時間的延長，越海9號和PS-7的葉片和莖的橫切面面積均顯著變小，PS-7的變化幅度大于越海 9號；在300 mmol·L-1NaCl處理12 h時，PS-7維管束中木質部已經損害嚴重，越海9號維管束中木質部則沒有明顯變化；PS-7的柵欄組織細胞在 300 mmol·L-1NaCl處理24 h時由長圓柱形變為卵圓形，越海9號的柵欄組織細胞的形狀則沒有變化。

生化研究表明，越海9號葉片中的葉綠素含量、超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性在 300 mmol·L-1NaCl處理過程中均顯著高于 PS-7，而其丙二醛含量卻明顯低于PS-7。

本研究進一步驗證了越海 9號為耐鹽性強的品系，PS-7為耐鹽性弱的品系。葉片中柵欄組織和莖中木質部可能是海島棉響應鹽脅迫最敏感的部分，葉綠素、丙二醛、超氧化物歧化酶和過氧化物酶可作為鑒定棉花耐鹽材料的生理學指標。

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（責任編輯 楊鑫浩）

Morphological and Physiological Mechanism of Salt Tolerance in Gossypium barbadense to Salt Stress at Seedling Stage

ZHAO HaiYan1,2, WANG JianShe1, LIU LinQiang1, CHEN YongQuan1, LI MengFei1,LU QuanWei1, LIU Fang2, PENG RenHai1
(1School of Biotechnology and Food Science, Anyang Institute of Technology, Anyang 455000, Henan;2Institute of Cotton Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan)

2017-01-09；接受日期：2017-03-27

棉花生物學國家重點實驗室開放課題（CB2015A23）、河南省高等學校重點科研項目（15A180026）、安陽工學院校科研基金項目（YJJ2015014）、博士啟動金項目（400721）、安陽工學院2016-2017學年大學生科技創新項目（36，97）

聯系方式：趙海燕，E-mail：zhaohaiyan111111@163.com。王建設，E-mail：wongjaction@163.com。趙海燕和王建設為同等貢獻作者。通信作者劉方，E-mail：liufcri@163.com。通信作者彭仁海，E-mail：aydxprh@163.com