辣椒病毒誘導基因沉默接種方法的優化

李然然　王述彬　潘寶貴

摘要：病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，簡稱VIGS）技術在候選基因功能驗證方面起著非常重要的作用。以辣椒八氫番茄紅素脫氫酶基因（簡稱PDS）為目標基因，分析表達載體轉化農桿菌的菌液在LB液體培養基和誘導培養基（IM）中D600 nm值的變化趨勢。結果表明，當LB液體培養基中菌液D600 nm值為1.15時，后續利用IM培養菌液的效率最高，PDS基因沉默效果明顯；優化了農桿菌接種方法，可為辣椒利用VIGS技術進行候選基因的功能驗證提供參考。

關鍵詞：辣椒；VIGS；農桿菌接種；基因沉默

中圖分類號： Q786文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0082-03

病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing，簡稱VIGS）是通過攜帶靶基因的病毒侵染植株從而引起寄主植株對應的目標基因沉默，使該基因不能繼續表達，進而探究基因功能的一種方式[1-2]。目前，VIGS技術已被廣泛應用，棉花[3]、煙草[4]、擬南芥[5]、大麥[6]、大豆[7]等植物都已經成功構建了VIGS體系，茄科作物[8-10]也開始普遍利用VIGS技術研究基因功能。候選基因VIGS載體構建成功后，農桿菌接種侵染植株是VIGS的關鍵步驟，農桿菌菌液培養占據了大量的時間，其中菌液的D600 nm值是試驗的關鍵點。沉默八氫番茄紅素脫氫酶基因（簡稱PDS）可使植株出現明顯的白化癥狀，PDS基因常用作VIGS試驗的陽性對照基因[11]。本試驗以PDS為目標基因構建VIGS載體接種辣椒，分析在農桿菌振蕩培養過程中菌液的D600 nm值，從而簡化搖菌的測量次數，為利用VIGS方法進行候選基因功能驗證提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試辣椒材料為江蘇省農業科學院蔬菜研究所高效園藝作物遺傳改良重點實驗室保存的G43（Capsicum annuum L.）。VIGS載體pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS轉化農桿菌GV3101菌液引自西北農林科技大學。

1.2試驗方法

1.2.1植物材料培養2015年10月，利用RGL-P1000D人工氣候箱育苗，出苗前30 ℃、黑暗培養，出苗后，晝、夜溫度28、20 ℃，光照375 μmol/（m2·s）（光照—黑暗為12 h—12 h），濕度60%，培養至2張子葉完全展開、真葉尚未長出時用于接種。

1.2.2試劑配制試劑的配制參照Velásquez等[12]所述，配制體積稍有改動。

20×AB鹽配制：NH4Cl 20.00 g、MgSO4·7H2O 6.00 g、KCl 3.00 g、CaCl2 0.20 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，用超純水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min（若出現沉淀，需要渦旋），備用。

誘導培養基（IM）配制：2-（N-嗎啉）乙磺酸一水合物（MES）5.137 g、葡萄糖2.632 g、NaH2PO4 0.164 g，用超純水定容至500 mL，調節pH值為5.6，121 ℃滅菌20 min，待溶液冷卻后加AB鹽26.316 mL。IM當天或提前1 d配制，500 mL IM使用前加入500 μL 200 mmol/L乙酰丁香酮、26.316 mL 20×AB鹽、500 μL 50 mg/mL卡那霉素、利福平、慶大霉素。

200 mmol/L乙酰丁香酮配制：19.6 mg乙酰丁香酮溶于500 μL二甲基亞砜（DMSO）。

乙磺酸（MES）溶液配制：MgCl2·6H2O 1.016 5 g，MES 1.066 0 g，用超純水定容至500 mL，調節pH值至5.5，121 ℃滅菌 20 min。

1.3接種方法

參照Velásquez等[12-13]的方法。

1.3.1劃板在-80 ℃冰箱中取出pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS轉化農桿菌GV3101菌液，冰上融解，分別在三抗LB瓊脂板（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L 慶大霉素）上劃線，用封口膜封好，標注好名稱及日期，置于28 ℃培養36 h左右。

1.3.2挑取單菌落培養準備3個100 mL錐形瓶，分別加入10 mL液體LB培養基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L慶大霉素），再分別挑取pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS單菌落至錐形瓶中，用封口膜封好，28 ℃、200 r/min 培養。

1.3.3IM搖菌按1 ∶[KG-*3]25的比例混合菌液和IM。pTRV1配制2瓶，pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS各配1瓶，28 ℃、200 r/min 培養27 ～37 h至菌液D600 nm值達到0.5 ～0.8。

1.3.4收集菌體將菌液分別移入50 mL離心管中，4 ℃、3 000 g 離心10 min，移除液體，加入等體積MES重懸，4 ℃、3 000 g 再次離心10 min，收集菌體，用1/2體積的MES重懸。向pTRV1內加入200 mmol/L乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮終濃度為400 mmol/L，按1 ∶[KG-*3]1將pTRV1分別與pTRV2 ∶[KG-*3]

00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS混合，使乙酰丁香酮終濃度為200 mmol/L，D600 nm值約為0.6，置于22～25 ℃靜置3～5 h，用于注射接種。

1.3.5接種幼苗接種前1 d澆水。接種時，在子葉中下部靠近葉脈處用2 mL一次性注射器打孔，用無針頭的一次性注射器在子葉背面注射菌液，直至整張子葉充滿水漬。注意在注射不同菌液時要更換手套與注射器，避免交叉污染。

1.3.6接種后培養接種后，將幼苗置于人工氣候箱中，先18 ℃、黑暗條件培養2 d，再將培養條件調至晝、夜溫度22、18 ℃，光照375 μmol/（m2·s）（16 h—8 h），濕度60%條件下培養。接種后3 d控水以增加發病率。

1.4數據分析

試驗設5次重復，采用Eppendorf BioPhotometer plus測量菌液D600 nm值，利用Excel 2007工作薄進行數據整理分析。

2結果與分析

2.1不同LB菌液對IM菌液培養時間的影響

對pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS用LB培養基搖菌后D600 nm為1.00、1.05、1.10、1.15、1.20的菌液進行IM搖菌，用時20～23 h。結果發現，D600 nm值在1.15時進行IM搖菌是效率最高的（表1）。當D600 nm值為1.00時，用IM搖菌達不到D600 nm值為0.5；隨著LB培養基D600 nm值的增加，用IM搖菌的效率也逐漸增加，到D600 nm值為1.15時效率達到最高；當D600 nm值為1.20時，用IM搖菌的D600 nm值達到0.5的時間開始增加。

2.2不同菌體LB搖菌隨著時間D600 nm值的變化

分別對pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS用LB培養基搖菌，并分別在17、18、19、20 h測量菌液D600 nm值，做3次重復，取平均值，所得結果如圖1所示，三者柱狀圖相似，說明不同菌體之間搖菌時間與對應D600 nm值變化相似。因此，若想探究菌體搖菌時間與對應D600 nm值變化的關系，僅用1種菌體進行試驗即可。

2.3LB液體培養基培養菌液

用pTRV1探究菌體搖菌時間與對應D600 nm值變化的關系，挑取5個單菌落（A、B、C、D、E），分別用10 mL液體LB培養基在100 mL錐形瓶中28 ℃、200 r/min振蕩培養，所用時間及對應D600 nm值見表2。在搖菌19.0 h時菌液C、D、E的D600 nm值已達到0.90以上，增加測量密度，19.50 h后其D600 nm值達到1.00以上，進一步增加測量密度，結果菌液C、D在19.73 h、菌液E在19.70 h分別達到所需D600 nm值，而菌液A、B在搖菌19.00 h時D600 nm值在0.80左右，可不必增加測量密度。

根據測量結果，菌液在搖菌19.70～20.00 h后達到所需D600 nm值，若想減少測D600 nm的次數，可以在搖菌19.00 h時測D600 nm值，并根據所測值與表2中數據對比，估算再搖菌時間。如D600 nm值達到0.90，預計再搖45 min可達到所需值；D600 nm值達到1.00，預計再搖15 min即可達所需值。

2.4IM菌液培養時間與其濃度的關系

LB培養基搖菌D600 nm值達到1.15左右后，再按菌液 ∶[KG-*3]IM=1 ∶[KG-*3]25 的比例進行混合，做5次重復，分別為菌液1、2、3、4、5，繼續搖菌。由表3可以看出，在相同起始D600 nm值下，再進行IM搖菌，所需搖菌時間也有些差異。一般來說，當LB培養基D600 nm值達到1.15，再進行IM搖菌，可在搖菌后27 h測量，再根據所測數據估計搖菌時間。由于IM搖菌所需時間遠遠多于LB培養基，而且所需D600 nm值范圍并不是那么嚴格，在0.5～0.8 均可，初次測量D600 nm值時間可以稍微晚一點。

由于菌液在不同D600 nm值下的增長速度不同，計算不同菌液在不同時間段的平均值可能與菌液的真正D600 nm值變化有所差異，因此，菌液原始的D600 nm值變化更能說明問題，也更方便做類似試驗的研究人員查閱。

2.5MES重懸對菌液濃度的影響

2.6pTRV2 ∶[KG-*3]PDS基因沉默效果

從圖2可見，接種pTRV2 ∶[KG-*3]PDS 3周后，辣椒幼苗葉片出現白化癥狀，其中第1、2張葉片的基部及主脈處明顯白化，第3張新生葉片全部白化；接種4周后，幼苗第1、2張葉片的白化范圍擴大，第3、4張新生葉片全部白化。接種空載體（pTRV2 ∶[KG-*3]00）幼苗比接種pTRV2 ∶[KG-*3]PDS幼苗的長勢稍好，而未接種植株（WT）明顯比接種植株長勢旺盛。本試驗方法能達到PDS基因沉默的目標，可用于后續的基因功能驗證。

3結論與討論

隨著VIGS技術的逐漸成熟，不同研究人員采用的農桿菌接種方法有所差異，有的用LB培養基搖過之后就直接用MES重懸[9]，此方法雖然也可以使基因沉默，但是用IM再次搖菌可以提高菌體活性，提高沉默效率。

在進行農桿菌接種試驗時，LB培養基搖菌的D600 nm值將影響后期IM搖菌的D600 nm值，本研究得出了最佳的LB培養基搖菌D600 nm值為1.15，而且通過所列舉IM搖菌數據可以推算所需搖菌時間，從而合理安排開始搖菌時間，因為IM搖菌時間過長會對菌體活性產生影響，盡量避開搖菌結束時間在晚上，以增加菌體活性，保證最高沉默效率。

Zhang等的試驗中僅說明了在LB液體培養液振蕩培養時需要24～36 h，IM振蕩培養時需20～24 h，本試驗探究LB培養基和IM搖菌時間與D600 nm值的關系，得出LB培養基搖菌要在搖菌17 h時測量D600 nm值，IM搖菌要在搖菌后27 h進行測量的結論[13]。所得時間節點與Zhang等稍微有所差別，但根據本試驗結果，在Zhang等的試驗條件下LB液體培養基濃度可能比較高，難以掌控菌體最佳活性時期。本試驗在Zhang等的基礎上更加精確了搖菌時間，方便研究人員參考查閱。

采用本研究方法接種，辣椒葉片白化癥狀明顯，說明本試驗方案可行，為應用VIGS技術研究辣椒相關基因功能奠定了基礎。

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