超聲波協同復合酶法提取桑黃多糖工藝優化

程俊文，賀 亮，魏海龍，宋吉玲，胡傳久，鄒景泉，李海波，蔣云鶴

（1. 浙江省林業科學研究院 浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；

2. 杭州市農業科學研究院， 浙江 杭州 310024）

doi:10.3969/j.issn.1001-3776.2017.04.006

超聲波協同復合酶法提取桑黃多糖工藝優化

程俊文1，賀 亮1，魏海龍1，宋吉玲2，胡傳久1，鄒景泉1，李海波1，蔣云鶴1

（1. 浙江省林業科學研究院 浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；

2. 杭州市農業科學研究院， 浙江 杭州 310024）

doi:10.3969/j.issn.1001-3776.2017.04.006

在單因素試驗的基礎上，通過Box-Benhnken組合設計和響應曲面分析法優化桑黃Inonotus sanghuang子實體中多糖的超聲波協同復合酶法提取工藝條件。在前期預實驗的基礎上，采用纖維素酶、果膠酶和蛋白酶按2:1:1組成復合酶對桑黃子實體進行酶解處理，添加量為2%，溫度50℃，pH 6.5，在水溶液中酶解1 h。然后對工藝中的超聲波功率、超聲時間、液料比進行優化。響應面分析結果表明，桑黃子實體中多糖的最佳提取條件為：超聲功率360.6 W，液料比32.5:1，超聲時間32.7 min，多糖得率可得3.31%，與理論值3.46%基本吻合。

桑黃；多糖；超聲波；復合酶；響應面

Abstract：Extraction technology of polysaccharide from Inonotus sanghuang was optimized by ultrasonic-assisted enzymatic method and response surface analysis. Based on the results of single factor experiment, enzymolysis of I. sanghuang sporcarp was carried out with 2% of complex phosphoesterasum (ratio of cellulose, pectinase, protease of 2:1:1) at 50℃ under pH of 6.5 for 1 hour. Then optimization of extraction technology was implemented on ultrasonic power, ultrasound time and ratio of liquid and material. The response surface analysis demonstrated that polusaccharide yield topped 3.31% under condition as follows: ultrasonic power 360.6W, liquid/material ratio 32.5:1, ultrasound treatment time 32.7minutes, similar to theoretical value of 3.46%.

Key words:Inonotus sanghuang; polysaccharide; ultrasonic; compound enzyme; response surface methodology

桑黃，中藥名，為桑黃纖孔菌Inonotus sanghuang的子實體，屬擔子菌亞門 Basidiomycotina[1]銹革孔菌科Hymenochaetaceae纖孔菌屬Inonotus，是一種珍貴的藥用真菌。醫學研究表明，桑黃具有抗腫瘤、抗氧化、抗肝纖維化、增強免疫等藥理活性[2-4]，被國際公認為抗腫瘤效果最好的藥用真菌之一。與大多數藥用真菌一樣，桑黃水提物的主要活性成分是多糖，而多糖是構成真菌細胞壁的主要成分，與纖維素、蛋白質等緊密聯結，不易分離。近年來，浙江、安徽等省桑黃人工栽培規模不斷擴大，因此對桑黃多糖提取技術的研究具有重要的意義。

目前，桑黃多糖的提取方法多為傳統的熱水浸提法，該法操作簡單，但提取時間長、提取率低。酶具有水解纖維素、原果膠和糖蛋白的作用，酶的高效性能夠節約提取能源與時間，酶的專一性使得到的產物穩定，純度、活性高[5]；超聲波是一種彈性波，產生并傳遞強大的能量，能使物質中分子加速運動，有利于植物細胞中的有效成分轉移、擴散及提取[6]。本實驗采用超聲波協同復合酶法提取桑黃多糖，達到提高多糖提取率的目的。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

桑黃子實體由浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室人工培育，菌種為桑黃纖孔菌，2015年5月采自浙江省淳安縣，采用液氮法保存；蛋白酶（酶活力8×104U?g-1）、果膠酶（酶活力9×104U?g-1）、纖維素酶（酶活力2.5×104U?g-1）均購自上海伯奧生物科技有限公司；苯酚、無水乙醇、氯仿、正丁醇均為國產分析醇，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

R-201旋轉蒸發器，上海申勝生物技術有限公司；20B型中藥粉碎機，南京邦斯特制藥設備有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海福瑪實驗設備有限公司；PL602-S電子天平，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；UV-2600紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 桑黃子實體多糖的提取 取干燥的桑黃子實體，用20B型中藥粉碎機粉碎成40目，用95%乙醇浸提12 h，抽濾，取濾渣風干粉碎備用。稱取1 g預處理子實體粉，按液料比40:1（mL:g）加水混勻，用檸檬酸調節pH值，根據各種生物酶的最佳酶活作用條件，在前期預實驗的基礎上，纖維素酶、果膠酶、蛋白酶按2:1:1組成復合酶，添加量為2%，溫度50℃，pH 6.5，在水溶液中酶解1 h，然后在一定液料比、超聲功率、超聲時間下利用JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機進行提取，3 000 r?min-1離心10 min，上清液用乙醇醇沉4 h后3 000 r?min-1離心5 min，沉淀溶解后測定。

1.2.2 響應面法分析實驗 選擇超聲功率、液料比、超聲時間3個因素所確定的水平范圍，運用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用3因素3水平的響應面設計，利用Design Expert 8.05軟件對實驗數據進行回歸分析。自變量的試驗水平分別以-1，0，1進行編碼，試驗因素及水平設計見表1。

1.3 分析方法

1.3.1 桑黃多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸比色法[7]。

1.3.2 多糖得率計算

多糖得率（Y）/%＝多糖含量×稀釋體積樣品干質量×100

1.3.3 實驗數據分析 用Design Expert 8.05進行數據分析和處理。

表1 響應面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結果與分析

2.1 響應面分析方案及結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，共有17個試驗點，其中12個為析因點，5個零點試驗用以估計試驗誤差。以多糖得率為響應值，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計方案及試驗結果Table 2 Design and results by RSM

2.2 回歸模型建立及方差分析

用Design Expert 8.05對表2實驗數據進行分析[8]，獲得多糖得率對超聲功率、液料比和超聲時間的多元二次回歸方程：

由表3可知，以多糖得率為目標函數的回歸方程的回歸效果達到極顯著水平，P值均＜0.000 1；模型的決定系數R2= 0.971 5，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數AdjR2= 0.934 8，說明該模型能解釋97.15%響應值的變化；模型的失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，表3中模型失擬項的P值為0.166 3，大于0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據表3的顯著性分析結果，各因素的一次項、二次項以及X1X3、X2X3的交互項對多糖得率的影響均呈顯著（P＜0.05）影響。分析表明這個模型建立的回歸方程能運用于超聲波協同復合酶法提取桑黃子實體多糖提取條件優化的理論預測。

表 3回歸模型方差分析Table 3 ANOVA of regression model

2.3 響應面圖形分析

分別將模型中的超聲功率、液料比及超聲時間的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結果，二次回歸方程的響應面及其等高線如圖1，圖2，圖3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應值的影響結果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響桑黃子實體多糖提取得率的最顯著因素為超聲功率（X1），表現為響應面變化弧度較大。超聲時間（X3）和液料比（X2）響應面弧度變化平緩，說明對響應值影響相對較小。

此外，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[9]。從圖1至圖3可以看出，X2與X3，X1與X3之間交互作用顯著。

圖1 超聲功率和液料比交互影響多糖得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 1 Surface diagram and contour of polysaccharide yield under interaction of ultrasonic power and liquid/ material ratio

圖2 超聲功率和超聲時間交互影響多糖得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 2 Surface diagram and contour of polysaccharide yield under interaction of ultrasonic power and treatment time

圖3 液料比和超聲時間交互影響多糖得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 3 Surface diagram and contour of polysaccharide yield under interaction of liquid/ material ratio and ultrasonic treatment time

2.4 驗證實驗

根據Box-Behnken試驗所得的結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 8.05分析，得到最佳提取條件為：超聲功率360.6 W，液料比32.5:1，超聲時間32.7 min，多糖得率理論值可達3.46%。

為檢驗模型預測值與實際實驗值之間的相關性，即檢驗響應面優化模型的可靠性，對桑黃子實體中多糖提取得率進行實驗驗證。實驗中超聲功率、液料比和超聲時間的優化值分別為360.6 W，32.5:1，32.7 min，三次平行實驗，測得多糖得率分別為3.29%，3.35%，3.28%，實際多糖得率平均值為3.31%，達到了回歸模型預測理論值的95.7%，實驗結果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預測桑黃子實體多糖得率。

3 結論

本實驗針對桑黃子實體組織結構木質化程度高，傳統的熱水浸提法多糖得率普遍較低的情況，通過集成運用生物酶法和超聲波法，先采用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶按2:1:1組成復合酶對桑黃子實體進行酶解處理，添加量為2%，溫度50℃，pH 6.5，在水溶液中酶解1 h。進而對工藝中超聲波功率、超聲時間、液料比等參數條件進行了實驗設計，根據Box-Benhnken中心組合實驗設計及三因素三水平的響應面分析，通過二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合，預測了桑黃子實體多糖的最佳提取工藝條件為：超聲功率360.6 W，液料比32.5:1，超聲時間32.7 min，多糖得率理論值可達3.46%。驗證實驗中多糖得率3.31%，與預測值十分接近，證明了該實驗方法的穩定性。

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Ultrasonic-assisted Enzymatic Method Extraction of Polysaccharide from Inonotus sanghuang

CHENG Jun-wen1，HE Liang1，WEI Hai-long1，SONG Ji-ling2，HU Chuan-jiu1，ZOU Jing-quan1，LI Hai-bo1，JIANG Yun-he1
（1. Zhejiang Academy of Forestry, Key Laboratory of Biological and Chemical Utilization of Forest Resources, Hangzhou 310023, China; 2.Hangzhou Academy of Agricultural Sciences of Zhejiang, Hangzhou 310024, China）

TQ461

A

1001-3776（2017）04-0033-06

2017-03-09；

2017-06-23

浙江省科技廳院所專項（2014F50018）；國家自然科學基金項目（31501815）；浙江省農業（食用菌）新品種選育項目（2016C02057-8）和杭州市科委種子種苗專項（20150932H07）的部分研究內容

程俊文，碩士，副研究員，從事食用藥用菌活性成分加工研究；E-mail：jwchengzj@163.com。通信作者：鄒景泉，工程師，從事森林資源研究；E-mail：422046791@qq.com。