耐鎘產鐵載體菌株的分離及鑒定*

趙樹民 虞方伯 葉正錢 方曉波 林海萍#

(1.浙江農林大學生物農藥高效制備技術國家地方聯合工程實驗室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省土壤污染生物修復重點實驗室，浙江 杭州 311300)

耐鎘產鐵載體菌株的分離及鑒定*

趙樹民1虞方伯2葉正錢2方曉波2林海萍1#

(1.浙江農林大學生物農藥高效制備技術國家地方聯合工程實驗室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省土壤污染生物修復重點實驗室，浙江 杭州 311300)

從黑麥草(LoliumperenneL.)根際土壤中分離到1株耐鎘產鐵載體細菌LY02，經形態觀察和16SrDNA序列測定以及同源性分析鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。該菌株能夠分泌吲哚乙酸(IAA)，促進磷的溶解，有利于提高黑麥草種子發芽率和抵抗鎘脅迫的能力，因此可以與黑麥草互利共生。該菌株對Cd2+的最大耐受質量濃度為10mg/L，可以促進土壤中的鎘向可溶性的生物有效態轉化，從而有利于黑麥草對鎘的富集。

產鐵載體細菌 黑麥草 鎘 植物修復 巨大芽孢桿菌

Abstract: A cadmium-resistant and siderophore-producing strain was isolated from rhizospheric soil ofLoliumperenneL.. Through morphological observation and 16S rDNA sequencing determination (including homology analysis),the strain was identified asBacillusmegaterium. This strain could produce indole-3-acetic acid and accelerate phosphorus dissolved. Moreover,the strain could promote the germination rate ofLoliumperenneL. seeds and resist Cd stress. Therefore,BacillusmegateriumandLoliumperenneL. could benefit each other. The maximum tolerant Cd2+mass concentration ofBacillusmegateriumwas 10 mg/L. At the same time,theBacillusmegateriumcould transform Cd into dissolved bio-available form,easy forLoliumperenneL. to accumulate.

Keywords: siderophore-producing bacteria;LoliumperenneL.; Cd; phytoremediation;Bacillusmegaterium

植物修復因成本低、污染少、操作簡單等優點而廣泛應用于土壤重金屬污染修復中[1]。然而用于植物修復的大部分超富集植物存在生物量小、生長緩慢、對重金屬具有選擇性等缺點[2]。研究表明，產鐵載體細菌產生的鐵載體能與重金屬結合形成絡合物，若產鐵載體細菌與超富集植物共生，有利于提高植物對重金屬的富集效率。然而，目前大部分研究的產鐵載體細菌并不直接來自于超富集植物，存在共生困難等問題。

多年生黑麥草(Lolium perenneL.)是禾本科中產量較高的一種重金屬超富集植物，具有環境適應性強、能耐受多種重金屬、生長速度快、分蘗力強、生物量大等優點。2014年，環境保護部發布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，無機污染物中鎘的污染最為嚴重，其點位超標率為7.0%。本研究嘗試從黑麥草根際土壤中篩選耐鎘產鐵載體細菌，對其進行分離和鑒定，以期為產鐵載體細菌與超富集植物共生、提高植物對重金屬的富集效率提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與培養基的配制

(1)LB液體培養基：胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、NaCl10.0g、蒸餾水1 000mL，調節pH為7.0。另加20.0g瓊脂變成LB固體培養基。

(2)MSA液體培養基：蔗糖20.0g、L-天冬氨酸2.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、蒸餾水1 000mL，用0.5g8-羥基喹啉除鐵，調節pH為7.0。

(3) 無機磷培養基(NBRIP)[3]:葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、MgSO4·7H2O0.3g、KCl0.3g、Ca3(PO4)25.0g、蒸餾水1 000mL，調節pH為7.0～7.5。

(4)Salkowski’s顯色劑：150mL濃硫酸溶于250mL蒸餾水中，加入7.5mL0.5mol/L的FeCl3溶液(溶劑為0.1mol/L的稀鹽酸)。

(5) 鉻天青S(CAS)檢測液[4]：將0.079gCAS溶于50mL蒸餾水中，再加入10mL1mmol/L的FeCl3溶液(溶劑為0.1mol/L的稀鹽酸)，記作溶液A。將0.069g十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)溶于40mL蒸餾水中，記作溶液B。將溶液A沿燒杯壁緩緩加入溶液B中，攪拌混勻即得CAS檢測液。

1.2 耐鎘細菌的分離、純化

在浙江農林大學平山試驗基地選取長勢較好的黑麥草植株，將其連根帶土裝入滅菌袋中帶回實驗室分離菌種。稱取黑麥草根際土壤10g，裝入三角瓶中并加入100mL無菌水，在150r/min條件下振蕩30min后靜置10min，吸取上層土壤懸濁液1mL，依次稀釋102、103、104、105、106倍，然后各取100μL涂布于含2mg/LCd2+的LB固體培養基上，28 ℃倒置培養3d，挑取生長良好的單菌落純化，-80 ℃保存。

取含有100mg/LL-色氨酸的LB液體培養基50mL分裝于250mL三角瓶中，接種分離、純化得到的耐鎘細菌菌液，28 ℃、150r/min振蕩培養2d。

1.3 菌株特性研究

產吲哚乙酸(IAA)檢測：取5mL菌液于離心管中，6 000r/min離心10min后，取1mL上清液，加2mLSalkowski’s顯色劑，充分混合，黑暗條件下顯色30min， 530nm波長下測定吸光度，以未接種菌株的培養液為參比，每組做3個重復取平均值并計算IAA濃度。

溶磷能力檢測：采用姜瑛等[5]的方法，將菌液接種于NBRIP中，28 ℃、150r/min條件下培養7d，6 000r/min離心10min后取上清液1mL，采用鉬銻抗比色法測定上清液中溶解性磷含量。以不接種菌株的NBRIP為空白對照，重復3次取平均值。

產鐵載體能力檢測[6]：取50μL菌液接種到MSA液體培養基中，28 ℃、150r/min條件下培養48h，10 000r/min離心10min，取上清液3mL與3mLCAS檢測液充分混勻，靜置1h，在630nm波長處測定吸光度，用未接種菌株的培養液作參比，重復3次取平均值，根據文獻[7]的方法計算鐵載體活性(SU)，SU越大，表明菌株產鐵載體能力越強。

1.4 菌株鑒定

形態觀察：利用荷蘭飛納Pro掃描電子顯微鏡觀察細菌形態。

16SrDNA序列測定與同源性分析：聚合酶鏈式反應(PCR)的正向引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物1513R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反應在94 ℃預變性5min；94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，30個循環；72 ℃延伸10min。擴增產物測序后提交GenBank進行同源性比對，并用NJ法在Mega5軟件中構建系統發育樹，其中Bootstrap值設為1 000。

1.5 菌株的耐鎘性測試及對土壤中鎘的活化能力

取50μL菌液接種于含Cd2+質量濃度為1、2、5、10、20mg/L的LB液體培養基中，置于28 ℃、150r/min的搖床中培養3d，觀察其能否生長以獲得菌株的最大耐鎘濃度[8]。

取50μL菌液接種于LB液體培養基中，28 ℃、150r/min培養24h，6 000r/min離心10min，取10mL上清液添加到5.0g鎘污染土樣中，充分混勻，重復3次，置于28 ℃下培養7d后，6 000r/min離心10min，用PerkinElmer7000DV電感耦合等離子發射光譜儀(ICP-OES)檢測上清液中Cd2+含量[9]。以未接種菌液的LB液體培養基為對照。

1.6 菌株對鎘脅迫下黑麥草種子萌發的影響實驗

菌懸液的制備：取50μL菌液接種于100mLLB液體培養基中，28 ℃、150r/min培養48h，6 000r/min離心10min，棄上清液，再用無菌水沖洗菌體5遍，添加適量無菌水使每毫升菌液中含108cfu的細菌。再添加Cd2+使得Cd2+質量濃度分別為0、1、5、10、15mg/L。對照組以等量的無菌水代替50μL菌液。

黑麥草種子(購于臨安種子站)用75%(體積分數)的酒精消毒3min，用無菌水沖洗5遍。選取飽滿的種子放置于墊了兩層無菌濾紙的培養皿中，每個培養皿50顆，加入上述菌懸液5mL，在溫度為25 ℃，濕度為60%的恒溫恒濕培養箱中培養。以長出1cm的苗長作為發芽標準，每天統計發芽數，培養7d后計算發芽率。

2 結果與討論

2.1 菌株特性分析

在2mg/LCd2+脅迫下的LB固體培養基中共分離、純化出3株生長良好的耐鎘菌株，分別記作LY01、LY02和LY03。

由表1可見，3株菌株都能產生IAA，能夠促進磷的溶解，具有產鐵載體能力。IAA是植物生長過程中十分重要的生長激素，能調控植物根、莖、葉的生長和各組織的形成發育等。由微生物產生的IAA也能促進植物的生長[10]，所以有利于與超富集植物共生。磷是植物生長的必需元素，然而土壤中的磷大部分都以難溶態的形式存在，植物很難直接利用，若共生細菌能夠促進磷的溶解顯然有利于植物生長。3株菌株中LY02產生的IAA質量濃度最高，為26.5mg/L；其溶磷能力最強，溶解性磷質量濃度為96.3mg/L；SU最大達到86.1%，屬于高產鐵載體細菌。因此，后續實驗選取LY02作為目標耐鎘產鐵載體細菌。

表1 株菌特性分析結果

2.2 菌株的鑒定結果

菌株LY02在LB固體培養基上的菌落為乳白色，近圓形，邊緣規則，表面光滑，濕潤，不透明。在11 000倍掃描電子顯微鏡下觀察到的形態為桿狀，產近球形芽孢(見圖1)。

圖1 菌株LY02在掃描電子顯微鏡下的形態(×11 000)Fig.1 Morphology of strain LY02 under the scanning electron microscope(×11 000)

從圖2的系統發育樹結果看，菌株LY02與BacillusmegateriumNBRC 15308的相似性最高，因此可以推斷LY02為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，與形態分析結果也一致。

圖2 菌株LY02的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain LY02

2.3 菌株的耐鎘性和對土壤中鎘的活化能力

耐鎘性測試結果表明，耐鎘產鐵載體細菌巨大芽孢桿菌對Cd2+的最大耐受質量濃度為10 mg/L。

在對土壤中鎘的活化能力實驗中，實驗組Cd2+質量濃度達到6.5 mg/kg，而對照組Cd2+質量濃度僅為4.2 mg/kg。也就是說，耐鎘產鐵載體細菌巨大芽孢桿菌能促進土壤中的鎘向可溶性的生物有效態轉化，從而有利于超富集植物對鎘的富集，提高富集效率。

2.4 菌株對黑麥草種子發芽率的影響

種子發芽是植物生長的起點和關鍵時期，此時種子對外界環境十分敏感。其中發芽率是非常直觀的指標。黑麥草種子在不同Cd2+濃度脅迫環境中的發芽率如圖3所示。從圖3可以看出，無論是實驗組還是對照組，隨著Cd2+濃度的升高黑麥草種子發芽率均下降。在相同Cd2+濃度脅迫下，實驗組由于與巨大芽孢桿菌共生，黑麥草發芽率高于對照組，低濃度時這種差異不顯著，但高濃度時差異顯著(P<0.01)。因此，耐鎘產鐵載體細菌巨大芽孢桿菌與黑麥草種子共生有利于提高其發芽率和抵抗鎘脅迫的能力。

注：相同字母表示在P<0.01水平上差異不顯著，不同字母表示在P<0.01水平上差異顯著。

圖3巨大芽孢桿菌對鎘脅迫下黑麥草種子發芽率的影響
Fig.3 Effects ofBacillusmegateriumon germination rate ofLoliumperenneL. seeds under Cd stress

3 結 論

從黑麥草根際土壤中分離得到耐鎘產鐵載體細菌LY02，經鑒定為巨大芽孢桿菌。該菌株能夠分泌IAA，促進磷的溶解，有利于提高黑麥草種子發芽率和抵抗鎘脅迫的能力，因此可以與黑麥草互利共生。該菌株對Cd2+的最大耐受質量濃度為10 mg/L，可以促進土壤中的鎘向可溶性的生物有效態轉化，從而有利于黑麥草對鎘的富集。

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Isolationandidentificationofacadmium-resistantandsiderophores-producingstrain

ZHAOShumin1,YUFangbo2,YEZhengqian2,FANGXiaobo2,LINHaiping1.

(1.NationalJointEngineeringLaboratoryofBiopesticidePreparation,ZhejiangAgriculturalandForestryUniversity,HangzhouZhejiang311300；2.KeyLaboratoryofSoilContaminationBioremediationofZhejiangProvince,HangzhouZhejiang311300)

趙樹民，男，1992年生，碩士研究生，主要從事土壤生態修復研究。#

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*浙江省重點創新團隊項目(No.2013TD12);浙江省科技廳公益技術研究農業項目(No.2015C32078)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.09.014

2016-11-10)