組蛋白去乙?；?下調SIX1的表達以抑制結直腸癌細胞增殖的研究

王加偉,許安東,朱云祥

(揚州大學附屬醫院 普外科,江蘇 揚州,225000)

論著

組蛋白去乙?；?下調SIX1的表達以抑制結直腸癌細胞增殖的研究

王加偉,許安東,朱云祥

(揚州大學附屬醫院 普外科,江蘇 揚州,225000)

目的探討組蛋白去乙酰化酶5(HDAC5)在結直腸癌組織中的表達情況以及在結直腸癌細胞系中的機制。方法采用免疫組織化學技術檢測HDAC5在結直腸癌組織中的表達情況，分析HDAC5表達量與患者生存預后的關系。在細胞水平敲除HDAC5后，觀察細胞的增殖、遷移能力以及凋亡功能的變化。結果HDAC5在結直腸癌組織中的陽性表達與生存預后較差顯著相關。在腫瘤細胞系中,HDAC5通過調控SIX1影響細胞的增殖。結論HDAC5在結直腸癌組織表達有差異，與結直腸癌生存預后相關，并可通過調控SIX1的表達影響細胞的增殖。

結直腸癌;組蛋白去乙?；?SIX1;增殖

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate expression of histone deacetylase 5 (HDAC5) in normal and colorectal cancer (CRC) tissues and its mechanism.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of HDAC5 in CRC tissues.The relationship between HDAC5 expression content and survival prognosis was analyzed.Proliferation,immigration and apoptosis changes were observed after knockdown of HDAC5.ResultsPositive expression of HDAC5 in tumor tissue was related with poor prognosis of CRC patients,and HDAC5 could inhibit the LS174T cell proliferation by regulating the SIX1 expression.ConclusionOur results reveal that HDAC5 expression is variant in CRC tissues,and it is correlated with prognosis of colorectal cancer,and can affect cell proliferation by regulating the SIX1 expression.

KEYWORDS:colorectal cancer;histone deacetylase;SIX1;proliferation

結直腸癌是常見消化道惡性腫瘤之一，其發病率隨年齡增長而逐漸升高，而遠期生存率則逐漸降低，且男性發病率和死亡率相對于女性較高，總體發病率和死亡率逐年升高[1]。腫瘤早期無轉移的患者5年生存率80%～90%,而晚期轉移的患者僅為10%～20%[2]。腫瘤的根治性切除已經明顯增加了患者的5年生存率，但是結直腸癌是一種具有高度特異性的惡性腫瘤，其在臨床病理特征、組織形態、免疫表型、治療效果以及生物學行為等方面存在較大差異，腫瘤的轉移和復發仍然是患者重要的死亡原因[3-4]。

組蛋白的乙酰化與去乙?；钠胶馐钦{節DNA復制與修復、有絲分裂過程、染色質結構的重要機制。組蛋白的去乙?；侨コ嚢彼釟埢弦阴；淖饔?，恢復組蛋白的正電性，增加組蛋白與帶負電的DNA間的吸引力，從而阻止轉錄調控元件靠近啟動子而達到抑制基因轉錄的作用[5-7]。去乙酰化過度會導致調節腫瘤細胞增殖與遷移、血管生成與分化、浸潤和轉移相關的抑癌基因的轉錄抑制，從而引起腫瘤的發生，而去乙?；@一反應主要由去乙酰化酶催化[8-9]。作為Ⅱ型去乙酰化酶家族成員之一的去乙?；?(HDAC5)[10],在急性髓性白血病[11]、骨肉瘤[12]、髓母細胞瘤[13]、肺癌[14]等腫瘤細胞中均有表達上調，且在髓母細胞瘤中,HDAC5的表達上調和該疾病的預后呈負相關[13],在結直腸癌中的也有相關報道[15-16]。作者設想HDAC5在結直腸癌中的表達程度與腫瘤患者的預后是否相關，能否通過抑制HDAC5在結直腸癌細胞系中的表達來影響細胞的增殖、遷移和凋亡功能。

1 材料與方法

1.1 組織樣本及細胞培養

本研究中，患者蠟塊組織來自新華醫院結直腸癌診治中心(免疫組織化學芯片，包含180例患者樣本信息)。本實驗通過了新華醫院倫理委員會，每位參與者都簽訂了知情同意書。研究中用到的細胞系(RKO,LOVO,HT29,SW48,HCT116,LS174T,SW480,SW620,293FT)均從中國科學院購買，培養條件是DMEM培養基+10%胎牛血清+1%雙抗，細胞培養在37℃、5%CO2條件下。

1.2 質粒構建和慢病毒包裝感染

HDAC5,SIX1敲除序列參考Sigma公司網站，插入PLKO載體中，與包裝質粒PAPAX2和PMD2G共轉染293FT細胞，收取上清病毒液離心后感染細胞，采用Puromycin (Sigma)篩選穩轉細胞株。

1.3 實時定量PCR和Western Blot

cDNA均由細胞中的總RNA(Trizol法)反轉錄獲得，使用SYBR Green Premix Ex Taq 試劑盒于ABI 7500系統進行實施定量PCR實驗，試劑盒均買自Takara公司。

參考碧云天細胞裂解試劑盒(P0013B),裂解細胞提取總蛋白，采用BCA試劑盒(碧云天)進行蛋白定量，取20 μg總蛋白,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移到NC膜上,5%濃度的牛奶封閉后，一抗(1∶1 000)稀釋后加入孵育,β-Actin作為內參,二抗孵育后(2∶1 000),用 Milipol化學發光試劑盒檢測蛋白強度。見表1。

表1 HDAC5的相關引物

1.4 免疫組織化學

免疫組織化學實驗采用SP法，操作過程嚴格參照說明書進行，一抗購自Sigma公司，陽性對照使用由既往實驗證實的陽性組織，陰性對照使用PBS代替一抗。結果分析:棕黃色顆粒為陽性顆粒，根據染色強弱，染色強度評分為0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(陽性)以及3分(強陽性);根據染色百分比，染色百分比評分為1分(<25%細胞染色),2分(25%～50%細胞染色),3分(51%～75%細胞染色)，以及 4分(>75%細胞染色)，最后的免疫評分(IRS)為細胞染色強度評分和染色百分比評分的乘積。IRS 0～4分為陰性,IRS 5～12分陽性。采用SPSS 16.0統計軟件，圖片數據使用Graphpad處理。

2 結 果

組織芯片免疫組織化學結果顯示,HDAC5在結直腸癌組織中存在差異性表達，通過分析生存預后數據發現,HDAC5陽性的患者生存預后相對于陰性的患者較差，差異有統計學意義(P<0.05)。HDAC5蛋白表達的陽性率與結直腸癌臨床分期、浸潤深度以及生長部位、性別等其他臨床特征無關，而Ⅲ期和Ⅳ期的陽性率顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期(0.738∶0.545,P=0.011),見表2,圖1A、B。180位患者HDAC5組織芯片Kaplan-Meier生存曲線顯示，在80個月的隨訪中，高表達HDAC5的患者生存時間較低表達的患者顯著較短(P=0.002)。見圖1C。

A.腫瘤細胞的陰性染色;B.腫瘤細胞的陽性染色(200倍);C.180位患者HDAC5組織芯片Kaplan-Meier生存曲線圖1 HDAC5免疫組織化學結果

表2 HDAC5的陽性表達與臨床特征的關系

與同一臨床特征另一亞項比較,*P<0.05。

在本實驗中心，所有的結直腸癌細胞系(RKO,LOVO,HT29,SW48,HCT116,LS174T,SW480,SW620)中檢測蛋白水平HDAC5的表達情況發現,LS174T細胞系中的HDAC5表達水平明顯比其他細胞系高。將此細胞系感染HDAC5 knockdown病毒后發現,HDAC5在mRNA和蛋白水平敲除效率均較好，同時發現HDAC5敲低后SIX1的表達下調明顯，且敲除HDAC5后的細胞增殖明顯比對照組的細胞慢。見圖2。LS174T細胞系感染SIX1 knockdown病毒后，在mRNA和蛋白水平SIX1均得到了明顯的敲低，同樣細胞的增殖也明顯比對照組細胞慢。見圖3。

3 討 論

目前，結直腸癌作為世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病機制仍不明確，盡管根治性切除已經很大程度上延長了患者的生存期，但腫瘤的早期癥狀不明顯，大部分腫瘤患者確診時已處于中晚期，無法通過手術或放化療達到根治疾病的目的，腫瘤的晚期轉移和復發仍然是結直腸癌患者死亡的重要原因[17]。組蛋白的乙?；c去乙?；钠胶庥绊懼毎亩囗椆δ?HDAC5作為Ⅱ型去乙酰化酶家族成員之一，在多種腫瘤的發生發展起著重要的作用，影響患者的預后。分析組織芯片免疫組織化學結果發現,HDAC5蛋白表達量較高的患者的生存預后比蛋白低表達患者要短，進一步綜合分析后發現,HDAC5蛋白在結直腸癌Ⅲ期和Ⅳ期患者組織中的陽性率高于Ⅰ期和Ⅱ期的患者(0.738∶0.545,P=0.011)。

在8種結直腸癌細胞系中檢測HDAC5的蛋白表達情況發現,LS174T細胞中的HDAC5表達顯著高于其他細胞系，由此采用該細胞系進行進一步的下游實驗。采用293FT細胞包裝HDAC5 knockdown病毒后感染LS174T細胞后發現，無論是mRNA水平還是蛋白水平,HDAC5的表達都顯著降低。當HDAC5表達降低后，作者發現SIX1的表達水平也有所降低。通過進行HDAC5knockdown穩系的功能實驗發現,HDAC5 knockdown細胞的增殖明顯比對照組的細胞慢。作者構建SIX1 knockdown的病毒，并感染LS174T細胞后發現，mRNA水平和蛋白水平上,SIX1的表達均明顯降低，同樣細胞功能實驗發現SIX1 knockdown的細胞的增殖比對照組慢。

A:結直腸腫瘤細胞系中HDAC5蛋白水平表達情況;B、C、D:LS174T細胞系感染HDAC5 knockdown病毒后,mRNA和蛋白水平的HDAC5和SIX1表達均比對照組明顯降低;E:采用Cell Counting Kit (CCK-8)試劑盒測定細胞增殖后發現，敲除HDAC5后的細胞增殖明顯比對照組細胞慢(*P<0.05,**P<0.01)。

SIX1是一種與果蠅正弦眼發育有關的基因，在人類組織中相對比較保守[18]。在多種器官的發育早期,SIX1的表達相對較高，但是在成人的組織器官中較低甚至是缺失[19]。Coletta等[20]發現SIX1可以通過上調Cyclin A1促進乳腺癌細胞的增殖，以及在橫紋肌肉瘤的轉移功能中起著重要的作用[21-24]。作者發現HDAC5在患者組織中高表達與預后較差相關，且HDAC5可以通過下調SIX1來抑制結直腸腫瘤細胞的增殖，為HDAC5抑制劑的研究和臨床應用提供一定的理論和實驗基礎[25-27]。

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Studyoninhibitionofcolorectalcancercellproliferationviadown-regulationofSIX1expressionofhistonedeacetylase5

WANGJiawei,XUAndong,ZHUYunxiang

(DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu,225001)

R 735.3

A

1672-2353(2017)17-001-05

10.7619/jcmp.201717001

2017-03-20

中國博士后科學基金面上項目(2012M511109)

朱云祥