釀酒酵母枸杞發(fā)酵物抗氧化性能研究

宋明輝，桑娜，喬長晟，3，*

（1.天津科技大學生物工程學院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津300457；3.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津300457）

釀酒酵母枸杞發(fā)酵物抗氧化性能研究

宋明輝1，2，桑娜1，2，喬長晟1，2，3，*

（1.天津科技大學生物工程學院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津300457；3.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津300457）

以編號為TJKD01～TJKD21的釀酒酵母和寧夏枸杞為原料，以多糖為主要指標，篩選獲得了一株能夠提高多糖含量的釀酒酵母。檢測發(fā)酵前后主要成分多糖、多酚、黃酮、類胡蘿卜素的含量變化，并用DPPH自由基清除法、鄰二氮菲-Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法考察枸杞發(fā)酵物的抗氧化性能變化。試驗結(jié)果表明，編號為TJKD08的釀酒酵母發(fā)酵可以提高多糖和多酚含量。發(fā)酵后多糖和多酚含量分別提高了27.6%和77.8%。發(fā)酵后DPPH自由基IC50由0.78 g/L變?yōu)?.43 g/L，羥自由基IC50由14.1 g/L變?yōu)?.2 g/L，超氧陰離子自由基IC50由7.7 g/L變?yōu)?.4 g/L，抗氧化能力得到提高。

枸杞；發(fā)酵；抗氧化性能

Abstract：Using Saccharomyces cerevisiae （TJKD01-TJKD21）and Ningxia wolfberry as raw materials，polysaccharides was selected as the main index to obtain a strain ofSaccharomyces cerevisiaewhich could increase the polysaccharides content.The contents of polysaccharides，polyphenols，flavonoids and carotenoids were determined before and after fermentation.The antioxidant activities of the fermented products ofLycium barbarumL.were studied by DPPH radical scavenging method，phenanthroline-Fe2+oxidation method and pyrogallolautoxidation method.The results showed that fermentation with TJKD08 could enhance the content of polysaccharides and polyphenls.After fermentation the polysaccharides and polyphenols content increased by 27.6%and 77.8%，respectively.After fermentation DPPH free radicals IC50changed from 0.78 g/L to 0.43 g/L，hydroxyl free radical IC50changed from 14.1 g/L to 8.2 g/L，IC50on superoxide anion free radical changed from 7.7 g/L to 5.4 g/L，antioxidant capacity has been improved.

Key words：Lycium barbarumL.；fermentation；antioxidant properties

枸杞（Lycium barbarumL.）為茄科枸杞屬（Lycium Linn.）植物，是我國傳統(tǒng)名貴藥材，其果實是一種“藥食同源”的功能保健性食品。現(xiàn)代藥理學研究認為枸杞具有提高機體免疫、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、明目以及保肝護肝等功能[1-4]。目前關(guān)于枸杞的研究集中于枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides，LBP）功能和枸杞飲料開發(fā)兩個方面。Zhang等[5]研究表明，LPB-d由8種單糖組成，LBP-e由6種單糖組成。LPB-d和LBP-e能使SMCC-7721細胞系分別停滯于G0/G1期和S期，其抑制率分別為26.7%和45.13%。兩個多糖組分都能提高細胞質(zhì)的Ca2+濃度，促進癌細胞凋亡。Maria Vittoria Varoni等[6]研究表明小鼠口服枸杞多糖可以保護肝臟，減輕由鎘中毒對肝臟造成的損傷。目前，枸杞保健食品的研究側(cè)重于飲料產(chǎn)品的開發(fā)。田海娟[7]等以人參、枸杞為原料，以開菲爾為發(fā)酵劑研制人參枸杞復配發(fā)酵飲品，通過正交試驗優(yōu)化出最佳發(fā)酵工藝，開發(fā)出一種口味良好，風味獨特的復合發(fā)酵飲品。馮霖等[8]以枸杞、大米為原料，通過根霉、酵母的糖化發(fā)酵，制成一種營養(yǎng)豐富、酒味鮮美的具有保健作用的低度枸杞米酒。

中藥發(fā)酵是借助于酶和微生物的作用，在一定的環(huán)境條件下（如溫度、濕度、空氣、水分等），使藥物通過發(fā)酵過程，改變其原有性能，增強或產(chǎn)生新的功效，擴大用藥品種，以適應臨床用藥的需要[9]。微生物在生長過程中可以分泌多種胞外酶于培養(yǎng)基中，這些酶可以促進胞內(nèi)物質(zhì)的釋放；同時，在這些酶的作用下一些前體物質(zhì)也有可能轉(zhuǎn)化為有效成分，從而提高有效物質(zhì)的含量。微生物次生代謝產(chǎn)物很豐富，這些次生代謝物與藥物成分發(fā)生協(xié)同作用可增強藥效，從而獲得藥效更強的藥物。因此中藥發(fā)酵炮制具有十分廣闊的前景。目前釀酒酵母發(fā)酵枸杞側(cè)重于釀酒工藝的研究，鮮有關(guān)于成分、功能變化的報道。

本文以寧夏枸杞和釀酒酵母為原料，通過使用釀酒酵母發(fā)酵枸杞，檢測發(fā)酵前后有效成分和抗氧化性能的變化，以期為枸杞保健食品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

編號為TJKD01～TJKD21的釀酒酵母：天津科技大學生化工程研究室保藏。

種子培養(yǎng)基：將10 g酵母粉、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖溶于水，定容至1 L，115℃滅菌20 min；發(fā)酵培養(yǎng)基：將枸杞粉碎后過40目篩，以料水比1∶5（g/mL）混勻，115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

打漿機：美的集團有限公司；HYG-WI型搖床：上海欣蕊自動化設備有限公司；YXQ-LS-75SⅡ型滅菌鍋：上海東亞壓力容器制造有限公司；UVmini-1240型紫外可見分光光度計：日本島津公司；TGL-16B高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

取一環(huán)菌種接種至種子培養(yǎng)基28℃，200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，再按2%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)3 d。

1.3.2 枸杞有效成分測定方法

將發(fā)酵液100℃煮沸20 min，促進有效物質(zhì)釋放到發(fā)酵液中。5 000 r/min離心10 min后，上清液用于測定多糖、多酚、黃酮含量，沉淀烘干后用于測定類胡蘿卜素含量。

1.3.2.1 多糖含量測定

取20 mL上清液和80 mL無水乙醇混勻，4℃靜置過夜，5 000 r/min離心10 min后棄上清，用等體積蒸餾水將沉淀溶解，稀釋后以葡萄糖作為標準品，使用硫酸-苯酚法[10]測定多糖含量。

1.3.2.2 多酚含量測定

將上清液稀釋，以沒食子酸作為標準品，使用酒石酸亞鐵比色法[11]測定多酚含量。

問題解決第三課時的教學我主要采用四人小組合作模式，讓學生自己去探索討論，體會如何按比例分配，從而掌握知識。我的設計流程如下：

1.3.2.3 黃酮含量測定

取上清液，以蘆丁作為標準品，使用張艷榮等[12]NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系分光光度法，測定黃酮含量。

1.3.2.4 類胡蘿卜素含量測定

將沉淀烘干測干重，加入石油醚超聲提取30 min，提取兩次，合并提取液，參考曹有龍等[13]的方法測定類胡蘿卜素含量。

1.3.3 抗氧化能力測定

將1.3.2得到的上清液真空干燥，計算溶解物的濃度。將樣品稀釋不同的倍數(shù)，參考Brand-Williams等[14]的方法測定DPPH自由基清除率。參考Qiu等[15]的鄰二氮菲-Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法測定羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

各菌株發(fā)酵后多糖含量見表1。

表1 各菌株發(fā)酵后多糖含量Table 1 Polysaccharides content of each strain after fermentation

續(xù)表1 各菌株發(fā)酵后多糖含量Continue table 1 Polysaccharides content of each strain after fermentation

使用不同的釀酒酵母對枸杞發(fā)酵，檢測發(fā)酵前后多糖含量變化。由表1可知，在21株不同來源的釀酒酵母中，大部分菌株發(fā)酵后多糖含量不變或下降。編號為TJKD08和TJKD09的釀酒酵母發(fā)酵后多糖含量分別由4.72 g/L提高至5.95 g/L和5.24 g/L，分別提高了26%和11%，編號為TJKD08的釀酒酵母發(fā)酵后多糖含量提高幅度最大，因此確定以其作為試驗菌株。

2.2 發(fā)酵對枸杞有效成分的影響

2.2.1 發(fā)酵對多糖、多酚含量的影響

發(fā)酵時間對多糖、多酚含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時間對多糖、多酚含量的影響Fig.1 Effects of fermentation time on polysaccharides and polyphenols content

在發(fā)酵過程中不同時間點取樣，檢測多糖和多酚含量。由圖1可知，使用編號為TJKD08的釀酒酵母發(fā)酵過程中，0～48 h多糖和多酚含量逐漸增多，多糖含量由4.7 g/L升高至6 g/L，多酚含量由0.18 g/L DW升高至0.32 g/L DW，分別提高了27.6%和77.8%，隨后兩者含量都略有下降，這可能是因為隨著時間的增加釀酒酵母開始分解、利用多糖和多酚。在48 h多糖和多酚含量最高，因此確定發(fā)酵時間為48 h。釀酒酵母在發(fā)酵過程中所分泌的酶和枸杞中的成分作用，促進了物質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高了多糖和多酚含量。

2.2.2 發(fā)酵對黃酮、類胡蘿卜素含量的影響

發(fā)酵時間對黃酮、類胡蘿卜素含量的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對黃酮、類胡蘿卜素含量的影響Fig.2 Effects of fermentation time on flavonoids and carotenoids contents

枸杞中含有豐富的黃酮類化合物和類胡蘿卜素，具有抗氧化、抗腫瘤、明目等生理活性。如圖2所示，發(fā)酵過程中黃酮、類胡蘿卜素含量不變。在釀酒酵母發(fā)酵過程中黃酮、類胡蘿卜素并未發(fā)生轉(zhuǎn)化。

2.3 發(fā)酵對抗氧化性能的影響

2.3.1 發(fā)酵對DPPH自由基清除能力的影響

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其孤對電子在517 nm波長附近有強吸收；當有自由基清除劑存在時，孤對電子被配對，吸收消失或減弱。因此通過測定吸收減弱的程度來評價抗氧化劑的抗氧化活性[16]。枸杞發(fā)酵物對DPPH自由基的清除作用如圖3所示。

圖3 枸杞發(fā)酵物對DPPH自由基的清除率曲線Fig.3 Scavenging effect ofLycium barbarumfermented product on DPPH radicals

由圖3可見，不同濃度的枸杞發(fā)酵物對DPPH自由基均有一定的清除作用。在試驗濃度范圍內(nèi)，枸杞發(fā)酵物對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增大而增大，當濃度大于1.2 g/L后，對DPPH自由基的清除作用增加變慢。IC50是DPPH自由基濃度減少一半的濃度。發(fā)酵前IC50為0.78 g/L，發(fā)酵后變?yōu)?.43 g/L，由此可以看出，發(fā)酵后的DPPH自由基清除能力明顯增強。

2.3.2 發(fā)酵對羥自由基清除能力的影響

枸杞發(fā)酵物對羥自由基的清除作用見圖4。

圖4 枸杞發(fā)酵物對羥自由基的清除率曲線Fig.4 Scavenging effect ofLycium barbarumfermented product on hydroxyl radicals

羥自由基是一種非常活躍、進攻性極強的活性氧自由基，其對生物體危害極大。由圖4可知，不同濃度的枸杞發(fā)酵物均對羥自由基具有良好的清除能力。在試驗范圍內(nèi)，羥自由基清除率隨著發(fā)酵物濃度的增加而增加。在枸杞發(fā)酵物濃度小于15 g/L時羥自由基清除率增加較快；當濃度大于15 g/L后，對羥基自由基的清除率增加變慢。相同濃度的樣品，發(fā)酵后的羥自由基清除率始終大于發(fā)酵前。發(fā)酵前IC50為14.1 g/L，發(fā)酵后變?yōu)?.2 g/L，經(jīng)過編號為TJKD08的釀酒酵母發(fā)酵，增強了對羥自由基的清除能力。

2.3.3 發(fā)酵對超氧陰離子自由基清除能力的影響

枸杞發(fā)酵物對超氧陰離子自由基的清除作用見圖5。

圖5 枸杞發(fā)酵物對超氧陰離子自由基的清除率曲線Fig.5 Scavenging effect ofLycium barbarumfermented product on superoxide radicals

超氧陰離子自由基可以作為多種活性氧的前體，雖然其本身氧化性較弱，但它在一定條件下會分解成氧化性很強的單線態(tài)氧自由基或羥自由基，具有更大的危害性。由圖5可以看出，發(fā)酵物濃度越大，超氧陰離子自由基清除率越大。在枸杞發(fā)酵物濃度小于14 g/L時，對超氧陰離子自由基的清除率增加較快；當濃度大于14 g/L后，對超氧陰離子自由基的清除率增加變慢，在濃度大于18 g/L后清除率趨于不變。發(fā)酵前IC50為7.7 g/L，發(fā)酵后變?yōu)?.4 g/L。經(jīng)過編號為TJKD08的釀酒酵母發(fā)酵，枸杞發(fā)酵物的超氧陰離子自由基清除率變大，抗氧化能力增強。

3 結(jié)論

通過對釀酒酵母篩選，找到了一株可以發(fā)酵枸杞提高多糖含量的釀酒酵母，經(jīng)過其發(fā)酵后，有效成分發(fā)生了較大變化。多糖和多酚含量分別提高了27.6%和77.8%，黃酮和類胡蘿卜素含量不變。發(fā)酵后的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和發(fā)酵前相比均大幅度提高，抗氧化能力得到強化。枸杞經(jīng)編號為TJKD08的釀酒酵母發(fā)酵后實現(xiàn)了物質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高了有效成分含量，從而提高了抗氧化能力。本試驗通過微生物發(fā)酵提高枸杞的抗氧化性能，為枸杞資源的開發(fā)利用提供了一定參考。

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Study on the Antioxidant Activity of the Wolfberry Fermentation by Saccharomyces cerevisiae

SONG Ming-hui1，2，SANG Na1，2，QIAO Chang-sheng1，2，3，*
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin 300457，China；2.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology，Tianjin 300457，China；3.Tianjin Peiyang Biotrans Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

2017-02-22

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.004

宋明輝（1991—），男（漢），在讀碩士研究生，輕工技術(shù)與工程專業(yè)。

*通信作者：喬長晟（1969—），男（漢），教授，博士，主要從事生物高分子及食品生物技術(shù)方向研究。