石榴酒體外及斑馬魚體內抗氧化活性研究

張洪亞，王振國，劉邦剛，楚杰，劉可春，楊桂文

（1.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014；2.山東省科學院生物研究所山東省生物檢測技術工程實驗室/山東省生物傳感器重點實驗室/山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東濟南250014；3.濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東濟南250002）

石榴酒體外及斑馬魚體內抗氧化活性研究

張洪亞1，2，王振國3，劉邦剛3，楚杰2，*，劉可春2，楊桂文1，*

（1.山東師范大學生命科學學院，山東濟南250014；2.山東省科學院生物研究所山東省生物檢測技術工程實驗室/山東省生物傳感器重點實驗室/山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東濟南250014；3.濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東濟南250002）

探對石榴酒的抗氧化活性進行研究，采用分光光度法測定石榴酒對DPPH·、·OH和O2-自由基的清除能力和石榴酒的還原力，并利用皮膚熒光斑馬魚進行石榴酒的抗氧化活性試驗。結果表明：石榴酒在一定范圍加入量內對DPPH·、·OH和O2-有良好的清除作用，清除率最大分別為92.95%、82.76%和63.85%。在對皮膚熒光斑馬魚進行石榴酒的抗氧化活性體內試驗中，石榴酒濃度在30、40、50μL/mL時，相對抗氧化能力分別達到了39.7%、60.3%、75.4%。

石榴酒；抗氧化活性；自由基；斑馬魚

Abstract：The study was to investigate the antioxidant activity of pomegranate wine.The antioxidant activity of the pomegranate wine was evaluated by spectrophotometry on its ability of scavenging 1-diphenyl-2-picrylhydrazy（DPPH·），hydroxyl radical（·OH），superoxide anion radical（O2-·）and total reducing power.The zebrafish with fluorescent skin was used to test the antioxidant activities of the pomegranate wine in vivo.The results showed that pomegranate wine had a well scavenging activity on DPPH·，·OH and O2-·in a certain range，and the highest scavenging activity were 92.95%，82.76%and 63.85%，respectively.In vivo experiment in zebrafish with fluorescent skin showed that the highest scavenging activity of pomegranate wine were 39.7%，60.3%and 75.4%in a certain concentration range（30，40，50 μL/mL）.

Key words：pomegranate wine；antioxidantactivity；free radical；zebrafish

石榴素有“九洲奇果”之美譽，果實富含多種氨基酸、碳水化合物、維生素和人體所必需的微量元素如鐵、銅、鋅等[1]。石榴果除鮮食外，還可加工成石榴果汁，果醋和果酒等多種產品[2-3]。石榴酒系采用石榴為主要原料，經破碎，發酵，分離，陳釀調配而成的果酒。石榴果酒中含大量多酚、類黃酮及花青素等高效抗氧化活性物質，同時含有大量的維生素C，有很強的抗氧化能力。其中，石榴酒中類黃酮的含量大大超過紅葡萄酒[4]，類黃酮可中和人體內誘發疾病與衰老的氧自由基，在延緩衰老，預防動脈粥樣硬化以及減緩癌變的進程等方面有著良好的作用[5]。此外石榴酒中的花色苷和多酚類化合物有明顯的抑菌消炎作用和抗癌、抗衰老、抗突變和防癌的作用，能有效地預防疾病的發生[6]。基于其諸多功效，石榴酒具有很好的保健功能，有廣闊的應用市場。

斑馬魚是一種亞熱帶淡水觀賞魚，體型小，繁殖速度快，培育簡便快捷，在胚胎發育時期身體透明可見，顯微鏡下易于觀察，被列為繼大鼠和小鼠之后的第三大模式生物。皮膚熒光轉基因斑馬魚是將熒光蛋白標記在角質細胞上，利用甲硝唑使皮膚細胞消融，然后再加入抗氧化物質，使有一部分皮膚細胞的熒光重新得以表達，從而量化抗氧化物質的抗氧化能力[7]。自由基是客觀存在的，過量的自由基對人體造成損害[8]，因此研究具有抗氧化作用的石榴酒意義重大。本文通過體外和體內試驗考察石榴酒的抗氧化能力，同時以VC作為對照，為石榴酒的開發和綜合利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴酒：山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室采用石榴汁發酵而成；DPPH：梯希愛（上海）化成發展有限公司；Tric-ainc MS222麻醉劑：Sigma公司；水為雙蒸水；甲硝唑溶液0.01 mol/L（DMSO溶解）；轉基因皮膚熒光斑馬魚cy17（krt4-NTR：GFP）：山東省科學院生物研究所繁殖；VC、DMSO、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、硝酸鋁、水楊酸、氫氧化鈉、雙氧水、無水乙醇等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

UV-2100型紫外可見分光光度計：上海合利儀器有限公司；Olympus SZX-16型熒光顯微鏡：日本Olympus公司；恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海賀徳實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 石榴酒體外抗氧化活性試驗

采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH自由基）法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法來進行抗氧化試驗，測定了石榴酒的總還原力，同時以VC為陽性對照。

1.2.1.1 DPPH·的清除試驗

用無水乙醇配置100 μmol/LDPPH自由基醇溶液，置于棕色瓶中備用。將3 mL DPPH自由基醇溶液分別加入到 1 mL 含有 5、10、20、30、40 μL 樣品的水溶液中，充分混勻，于避光處反應20 min后，在517 nm波長處測定吸光度。同時用VC溶液作陽性對照。DPPH自由基的清除率計算公式為

式中：Ai為樣品溶液的吸光度；Aj為石榴酒溶液在測定波長處的吸光度；Ao為未加石榴酒溶液的吸光度。

1.2.1.2 ·OH清除能力的測定

分別取石榴酒 10、80、160、240、320 μL 于試管中，并用雙蒸水補齊至2 mL，充分混勻，在反應體系中依次加2 mL濃度為9 mmol/L的FeSO4、2 mL濃度為9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、2 mL受試樣液、2 mL濃度為8.8 mmol/L的H2O2，混勻后在37℃下啟動反應，反應30 min后在510 nm波長處測其吸光值。同時以VC做為陽性對照進行測定，羥基自由基清除率計算公式為

式中：Bi為樣品溶液的吸光度；Bj為石榴酒溶液在測定波長處的吸光度；Bo為未加石榴酒溶液的吸光度。

1.2.1.3 O2-·清除能力的測定

分別取石榴酒 10、40、60、80、100、120 μL 于試管中，并用雙蒸水補齊至1 mL，混勻后，在反應體系中分別加4.5 mL濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液，于25℃水浴20 min后，再加1.0 mL不同濃度的受試樣液和0.5 mL 2.5 mmol/L在25℃下預熱過的鄰苯三酚溶液，混勻后在25℃下反應5 min后立即用2滴～3滴濃度為8.0 mol/L的HCl溶液終止反應，于320 nm處測吸光值，同時以VC做為陽性對照，超氧離子自由基清除率計算公式：

式中：Ci為樣品溶液的吸光度；Cj為石榴酒溶液在測定波長處的吸光度；C0為未加石榴酒時溶液的吸光度。

1.2.1.4 還原能力的測定

用移液槍準確取 40、80、120、160、200 μL 不同梯度體積的石榴酒加入到試管中，用雙蒸水補齊至2.5mL，然后加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的H3PO4緩沖液，再添加2.5 mL 1%的K3Fe（CN）6溶液后混勻。置于50℃的水浴鍋中反應20 min后，再加入2.5 mL 10%的C2HCl3O2溶液，混勻后在離心機中以3 000 r/min的轉速離心10 min，取離心后的上清液5 mL加入已添加0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液和4 mL蒸餾水的試管中，混勻。10 min后于700 nm處測定其吸光度。同時以VC作為對照。

1.2.2 斑馬魚體內抗氧化活性的研究

1.2.2.1 斑馬魚抗氧化原理

斑馬魚的皮膚由包膜和基底層組成，形成第一道防御系統。以往研究表明，魚的皮膚對外部刺激非常敏感，轉基因斑馬魚能有條件的引發皮膚表層細胞凋亡。皮膚熒光斑馬魚是將熒光蛋白標記在角質細胞上，對熒光角質細胞進行計數，如果一個細胞內的自由基導致了細胞受損，就會使線粒體膜穿孔，這些小孔會允許細胞色素C到達細胞質中，使得細胞色素C與Apaf-1結合形成聚合體，由ATP提供能量，這些聚合體進而使caspase-9裂解為caspase-3和caspase-7，這些裂解的caspase可以激活蛋白水解酶，使蛋白水解，并降解DNA。通過加入抗氧化物質來清除細胞內的自由基，從而減少細胞凋亡。轉基因熒光斑馬魚可通過熒光顯微鏡觀察到皮膚上顯示許多綠色的熒光亮斑點，與甲硝唑孵育，會引起細胞凋亡，使熒光斑點消失，當再加入抗氧化物質熒光斑點會恢復[9]。利用此特性進行抗氧化試驗，選擇皮膚熒光斑馬魚卵黃部位進行拍照，運用Image-Pro軟件計數各組的熒光點數量，可以測定藥物的相對抗氧化能力。

1.2.2.2 斑馬魚胚胎的準備

斑馬魚的養殖方法參照Westerfield[10]等的方法，選擇成熟的斑馬魚，按照雌魚與雄魚1∶1或者1∶2的比例置入繁殖缸內，次日清晨取出受精卵，加入亞甲基藍溶液，放入28℃培養箱中孵化，備用。

1.2.2.3 試驗分組與給藥

配制濃度分別為 5、10、20、30、40、50 μL/mL 的石榴酒樣液，并配制濃度為20、40、100 μg/mL的VC溶液。將孵化24 h的斑馬魚胚胎取出，加入1 mg/mL的鏈霉蛋白酶溶液中約3 min左右，脫去斑馬魚胚胎的外層卵膜將脫去卵膜的斑馬魚胚胎隨機分成4組：溶劑對照組、甲硝唑組、石榴酒組和VC組，每組7個胚胎，同時設置2個副孔，加入到24孔板中，每組試驗進行3次。

根據試驗分組，在溶劑對照組加入2 mL新鮮培養水，并用新鮮培養水配成0.01 mol/L的甲硝唑溶液。甲硝唑組、石榴酒組和VC組分別加入2 mL 0.01 mol/L的甲硝唑溶液，同時石榴酒組和VC組按照各自的濃度分別加入5 μL溶液，搖勻，將加樣后的24孔板置于28℃的恒溫培養箱中培養24 h。

將樣品板取出后，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎的生長狀況以及皮膚熒光的數量，同時為防止拍照過程中斑馬魚不斷的游動，在24孔板的每個帶有樣品的孔中加入適量的三卡因溶液對斑馬魚進行麻醉，利用Imagepro-plus軟件統計各組斑馬魚胚胎表面的熒光點數量，再利用SPSS軟件對數據進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 DPPH·的清除試驗

DPPH是一種穩定的以氮為中心順磁化合物，并具有孤對電子，在波長為517 nm處有最大吸收。當抗氧化劑存在時，孤對電子配對成電子對，是自身紫色變成黃色，導致在最大光吸收波長處的吸光值降低，其下降程度與自由基的清除程度呈線性關系，因此可以用分光光度計進行定量測定，從而評價試驗樣品的抗氧化能力[11]。石榴酒對DPPH自由基的清除作用見圖1。

圖1 石榴酒對DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging activity of pomegranate wine

如圖1所示，石榴酒對DPPH自由基的清除作用隨著樣品溶液濃度的增加而增大。在用量為5 μL～20 μL時，石榴酒對DPPH自由基清除率從62.08%增大到92.95%，當用量進一步增加到40 μL時，石榴酒對DPPH自由基的清除率增幅不明顯，基本保持不變。對照組 VC在濃度為 0.2 μg/mL～1.0 μg/mL 時對 DPPH自由基的清除率從86.23%增大到94.74%。由此可見，石榴酒對DPPH自由基具有一定的清除效果，用量達到一定量時與VC對DPPH自由基的清除效果相當。

2.2 清除羥基自由基能力的測定

羥基自由基（·OH）是生物體內活性氧代謝產生的物質，是一種氧化性很強的自由基，能引發不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，使機體發生氧化損傷[12]。通過水楊酸法測定石榴酒對羥基自由基的清除能力，Fenton反應產生·OH，·OH氧化水楊酸得到2，3-二羥基苯甲酸，檢測其在510 nm處的吸光度來表示·OH的多少，·OH的量與吸光度呈正比[13]。石榴酒對·OH自由基的清除作用見圖2。

圖2 石榴酒對·OH自由基的清除作用Fig.2·OH radical scavenging activity of pomegranate wine

試驗結果如圖2所示。在10 μL～320 μL用量范圍內，石榴酒對·OH清除率隨用量增加而明顯增大，清除率從36.41%增加到82.76%，增幅為46.35%，在用量為240 μL時繼續增加用量，清除率基本不變，達到最大清除率為82.76%。VC樣液濃度在1.0 μg/mL時對羥基的清除率為71.94%，說明石榴酒對羥基自由基有較好的清除作用。

2.3 清除超氧陰離子自由基能力的測定

O2-·是分子氧在生物體內氧化還原反應中產生的活性中間體，正常狀態下保持相對穩定的動態平衡，當細胞受到外界刺激時會產生過量的O2-·自由，使細胞產生氧化應激，引起機體病變[14]。運用四甲基偶氮唑鹽還原法，鄰苯三酚自氧化產生O2-·，O2-·可氧化成四甲基偶氮唑鹽生成藍紫色的化合物，測其吸光度來測定石榴酒樣品對O2-·的清除作用，試驗結果如圖3所示。

圖3 石榴酒對O2-·自由基的清除作用Fig.3 O2-·radical scavenging activity of pomegranate wine

由圖3可以看出，在20 μL～120 μL用量范圍內，石榴酒對超氧陰離子自由基的清除率從59.62%增加到63.85%，增幅為4.23%，說明石榴酒對O2-·有一定的清除作用，清除率在60%左右，相對VC對O2-·的清除作用較弱。

2.4 還原力試驗

抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子從而清除自由基，因而可通過一種物質還原力的大小來反映這一物質抗氧化能力。據研究，物質的還原力越強，其抗氧化能力越強[15]。通過普魯士藍法來測定石榴酒的還原力，其原理是石榴酒將鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]還原成亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6]，亞鐵氰化鉀再與Fe3+作用，生成亞鐵氰化鐵即普魯士藍，在700 nm波長下測定其吸光度，來表示還原力的大小，吸光度值越大，表明石榴酒的還原力越強[16]。結果如圖4所示。

由圖 4可以看出，石榴酒用量在 40 μL～120 μL 范圍內，吸光度隨石榴酒含量增加而增大，最高為0.81，VC溶液濃度在0.8 μg/mL時的吸光度為0.84，吸光度越大說明還原力越大，因此表明石榴酒具有較強的還原力。

圖4 石榴酒的還原力大小Fig.4 Reducing capacity of pomegranate wine

2.5 斑馬魚抗氧化活性試驗

運用轉基因皮膚熒光斑馬魚做石榴酒體內抗氧化試驗，試驗結果如表1所示，熒光圖片如圖5所示。

表1 石榴酒對皮膚熒光斑馬魚胚胎生成的影響Table 1 Effect of pomegranate wine on the skin fluorescent zebrafish embryo formation

圖5 石榴酒對斑馬魚的抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of pomegranate wine on the skin fluorescent zebrafish embryo formation

其中，溶劑對照組熒光點數為（55.2±6.0）個，甲硝唑組熒光點數為（8.8±2.3）個，相對抗氧化能力/%=（加樣組熒光細胞數量－甲硝唑組熒光細胞數量）/（溶劑對照組熒光細胞數量－甲硝唑組熒光細胞數量）×100

由表1可見，斑馬魚的皮膚熒光點數最多的是溶劑對照組，當加入甲硝唑后，絕大部分熒光點消失，結果如圖5中的B所示，再加入石榴酒樣品后，熒光點能夠再次更多的被觀察到，則說明石榴酒樣品具有抗氧化活性，且根據熒光點個數恢復的多少，來判斷抗氧化性的強弱。

3 結論

自由基是指能獨立存在的，含有一個或多個不配對電子的原子、原子團、離子或分子，本質上具有高度活性和潛在的損傷性，廣泛存在于機體組織中。一定數量的自由基對人體是有益的，病毒侵入后，在白細胞的表面就會產生自由基，這些自由基可以作為一種強氧化劑來殺死病毒。但是當自由基超過一定數量時，就會對人體造成損傷，利用抗氧化劑可以對多余的自由基進行淬滅，維護機體健康。本文對石榴酒進行抗氧化活性試驗，研究發現石榴酒具有較好的抗氧化能力，樣品加入量在一定范圍內對DPPH·、·OH和O2-·的清除率隨著加入量的增大而升高，有著明顯的量效關系，清除率最大分別為92.95%、82.76%和63.85%。在還原力試驗中，吸光度最高為0.81，與VC相比相差不大，說明石榴酒具有較好的還原力。

斑馬魚的魚皮缺乏角質層，直接由活細胞組成最外層皮膚，當遇到惡劣外界環境時角質細胞會發生凋亡。本研究利用甲硝唑使皮膚細胞消融，然后再加入抗氧化物質，減少了細胞毒性，使部分細胞恢復活性，一部分皮膚細胞的熒光重新得以表達，從而量化抗氧化物質的抗氧化能力。在本試驗中通過添加甲硝唑消除皮膚熒光點后，再添加石榴酒后，能夠重新在熒光顯微鏡下觀察到斑馬魚皮膚表面的熒光點，添加量為50 μL/mL時，相對抗氧化能力可達到75.4%，說明石榴酒具有良好的抗氧化活性。本研究表明石榴酒有較好的抗氧化活性，為石榴酒的開發利用提供了理論依據。

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Research in the Antioxidant Activity of Pomegranate Wine in vitro and Zebrafish in vivo

ZHANG Hong-ya1，2，WANG Zhen-guo3，LIU Bang-gang3，CHU Jie2，*，LIU Ke-chun2，YANG gui-wen1，*
（1.Life Sciences Institute，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China；2.Shandong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology/Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors/Key Laboratory for Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences，Institute of Biology，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，Shandong，China；3.School of Medicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medicine Sciences，Jinan 250002，Shandong，China）

2017-02-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.005

張洪亞（1992—），女（漢），在讀碩士研究生，生物工程專業。

*通信作者：楚杰（1965—），女（漢），研究員，主要從事微生物發酵方面的研究；楊桂文（1967—），男（漢），教授，碩士生導師，主要從事細胞生物學方面的研究。