新鮮仙人掌多糖的提取及其抗氧化活性研究

虞旦，謝婭霏，蘇寧，安全，趙丹，王昌濤，李萌，*

（1.北京工商大學理學院，北京100048；2.中國檢驗檢疫科學研究院化妝品技術中心，北京100176；3.云南白藥集團公司，云南昆明650500）

新鮮仙人掌多糖的提取及其抗氧化活性研究

虞旦1，謝婭霏1，蘇寧2，安全3，趙丹1，王昌濤1，李萌1，*

（1.北京工商大學理學院，北京100048；2.中國檢驗檢疫科學研究院化妝品技術中心，北京100176；3.云南白藥集團公司，云南昆明650500）

對新鮮仙人掌提取多糖最優工藝及其抗氧化效果進行研究。在單因素試驗的基礎上采用響應面法RSM對熱水浸提新鮮仙人掌多糖提取條件進行優化，優化后的工藝為：溫度64.25℃，時間1.5 h，液料比22.38∶1（mL/g），提取率高達（0.114 2±0.027 3）%，多糖純度為（37.686±9.009）μg/mL。利用體外實驗模型評價其抗氧化性，結果表明該提取液對3種自由基有一定的清除能力，且呈劑量相關性，濃度分別為5.58、10.04、8.78 mg/mL的提取液可清除50%的DPPH自由基、羥自由基和ABTS+自由基。

仙人掌多糖；熱水浸提；抗氧化性；響應面分析

Abstract：The extraction conditions ofO.dilleniipolysaccharide with a series of methods were examined.On the basis of one factor tests，the response surface methodology was used to optimize the boiling water extraction ofO.dilleniipolysaccharides.Design expert analysis indicated that the optimal processing conditions were：temperature 64.25 ℃，time 1.5 h，liquid to solid ratio 22.38 ∶1（mL/g），under these conditions，the extraction yield ofO.dilleniipolysaccharides was （0.114 2±0.027 3）%and mass concentration was （37.686±9.009）μg/mL.Vitro experimental model was used to evaluate the antioxidant activities，the results showed that the extracting liquid of theO.dilleniihad the capacity to scavenge three kind of free radical and scavenging activity was increased with the polysaccharide concentration.The extracting liquor with 5.58，10.04，8.78 mg/mL concentration of extracting liquor ofO.dilleniicould eliminate 50%DPPH free radical，hydroxyl radicals and ABTS+free radical．

Key words：O.dillenii polysaccharide；boiling water extraction；antioxidant capacity；response surface methodology（RSM）

仙人掌（Opuntia dilleniiHaw.），是石竹目仙人掌科（Cactaceae）的植物總稱，別名仙人扇、霸王樹、觀音掌、仙巴掌、火掌等，常生長于沙漠及半沙漠等干燥少雨環境中，大小及形態多樣，屬于多肉植物。

仙人掌多糖（Opuntia dilleniiPolysaccharides，ODP）是仙人掌主要生物活性成分之一，主要提取自仙人掌的莖和果實，主要由極性大分子化合物葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖等組成，活性較高，能夠降血糖血脂、抗氧化、抑菌和保濕。多糖不溶于乙醇，易溶于水，現在已有的研究中對多糖的提取常用的方法有水提、酸提、堿提、苯酚提取、超聲輔助提取、微波輔助提取和酶提取等方法[1]。多糖的生物學功能眾多，臨床作用廣泛，尤其是在美容方面，據研究，仙人掌多糖有保濕、穩定、改善膚色、抗衰老、抗菌等功能[2-5]，因而可作為美容食品和化妝品的有效成分。且高分子多糖無毒副作用，與常用化妝品成分配伍性好，作為功效型化妝品添加劑將有著廣闊的前景[6]。

目前，如何高效、高純度、低成本地從中提取仙人掌多糖是研究的重點。由于過酸、過堿或溫度物理條件過極端都會一定程度上破壞仙人掌多糖的結構，所以在本課題中，選用了熱水浸提法，將更有利于多糖結構的保護[7]，此外，新鮮仙人掌肥厚的肉質莖內含有豐富的礦物質、纖維素、SOD（Superoxide Dismutase，超氧化物歧化酶）和黃酮類等多種活性功能成分[8]，為更好地保留這些活性物質，所以本試驗用的是新鮮的去皮仙人掌進行熱提，提取率基數是新鮮仙人掌重量，區別于其他文獻中將仙人掌烘干成干粉再提取。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用生長期為3～8個月的新鮮仙人掌：云南白藥集團公司（這個生長期內的仙人掌富含仙人掌多糖ODP），未去皮原材料平均稱重約 130g/塊～200g/塊；葡萄糖、苯酚、硫酸、高氯酸、冰醋酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、福林酚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；水（過濾超純水）：由北京工商大學理學院實驗室制備。

1.2 儀器與設備

BS2202S型電子天平、A2492型電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；DQHZ-2001A大容量全溫度振蕩培養箱：江蘇省太倉市華美生化儀器廠；HH-2電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學儀器廠；DSHZ-300恒溫水浴振蕩器：江蘇省太倉市實驗設備廠；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；YZB-蘇（錫）1132-2004低速大容量多管離心機：無錫市瑞江分析儀器有限公司；HR2195攪拌機勻漿機：飛利浦有限公司。

1.3 方法

1.3.1 仙人掌多糖ODP含量測定

標準曲線的繪制，參照苯酚硫酸法[9]，經測定，在0～120 μg/mL濃度范圍內吸光度A490對多糖濃度進行線性回歸，標準曲線為：y=0.015 1x+0.004 2，R2=0.999 6，x為多糖濃度，μg/mL；y為吸光度值。

水溶性ODP樣品含量測定：準確吸取樣品1 mL置于試管中，吸取0.5 mL 5%苯酚于試管，搖勻待其充分反應，再加入2.5 mL濃H2SO4，蓋上試管蓋，充分搖勻，并靜置5 min；將反應后的試劑沸水浴1 h，取出在490 nm處測定吸光值A。

1.3.2 仙人掌熱水浸提法單因素試驗[10-12]

1.3.2.1 時間單因素試驗

選取 1、2、3、4、5 h 這 5 個時間梯度作時間的單因素探究試驗條件，固定液料比為20∶1（mL/g），提取溫度為70℃，提取pH值為7，取上層離心液6.6 mL，定溶于10 mL的容量瓶，測定多糖含量。設置3組平行。

1.3.2.2 溫度單因素試驗

選取 50、60、70、80、90 ℃這 5 個溫度梯度作溫度的單因素探究試驗條件，固定液料比為20∶1（mL/g），提取時間為3 h（因為3 h時的提取率更高一些），提取pH值為7，取上層離心液6.6 mL，定溶于10 mL的容量瓶，測定多糖含量。設置3組平行。

1.3.2.3 液料比單因素試驗

選取液料比 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）這6個梯度作液料比的單因素探究試驗條件，為保持與除單因素之外的大部分試驗條件相同，固定提取溫度為70℃，提取時間為3 h，提取pH值為7，取上層一定量離心液，使其稀釋倍數保持30倍，將溶液定溶于10 mL的容量瓶，測定多糖含量。設置3組平行。

1.3.2.4 pH單因素試驗

選取 pH 值為 3、4、5、6、7、8、9、10 這 8 個梯度作pH值的單因素探究試驗條件，為保持與除單因素之外的大部分試驗條件相同，固定液料比為20∶1（mL/g），提取時間為3 h，提取溫度為70℃，取上層離心液6.6 mL，定溶于10 mL的容量瓶，測定多糖含量。設置3組平行。

1.3.3 仙人掌熱水浸提法響應面試驗[13-16]

在單因素試驗的基礎上，選取對試驗結果影響較大的幾個因素進行響應面試驗設計（RSM），按照設計表格（見表1）進行試驗，并測定多糖含量。

表1 響應面RSM試驗因素水平表Table 1 Factors and levels for RSM experimental design

1.3.4 粗提ODP的制備[17-18]

采用響應面試驗所得的最優試驗方法進行多糖的提取，加入4倍體積的無水乙醇，冰箱冷藏24 h，次日于離心機3 000 r/min離心20 min，取沉淀，冷凍干燥，條件為-80℃，3 Pa，48 h。得到仙人掌粗多糖，再配置相當濃度的樣品液用于抗氧化性分析。

1.3.5 粗提ODP的抗氧化活性

將粗提仙人掌多糖配制不同濃度的ODP溶液，對不同濃度ODP溶液分別進行DPPH自由基、ABTS+自由基和羥自由基清除率試驗，同時計算半抑制濃度IC50。

1.3.5.1 DPPH自由基清除試驗[19]

取等體積（一般為3mL）的待測液與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻（1號管）；取等體積的水與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻（2號管）；取等體積的無水乙醇與待測液混勻（3號管）。反應30 min后，在517 nm處測1，2和3號管的吸光度值，分別記為 A1，A2和 A3。DPPH 自由基清除率/%=（A0+A2-A1）/A0×100。

1.3.5.2 羥自由基清除試驗[20]

取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.40）和 0.5 mL蒸餾水，充分混勻后，加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻后，加入0.5 mL 0.01%雙氧水，于37℃水浴60 min后，在536 nm測其吸光值，所得數據為損傷管吸光度A損傷。未損傷管以0.5 mL蒸餾水代替損傷管中的0.5 mL 0.01%雙氧水，操作方法同損傷管，測得未損傷管的吸光度值A未損傷。樣品管以0.5 mL樣品代替損傷管中的0.5 mL蒸餾水，操作方法同損傷管，測得樣品管中的吸光度A樣品。羥自由基清除率/%=（A樣品-A損傷）/（A未損傷-A損傷）×100

1.3.5.3 ABTS+自由基清除試驗[21]

將 5 mL 7 mmol/L ABTS+和 88 μL 140 mmol/L 過硫酸鉀溶液混合，在室溫、避光條件下靜置過夜，形成ABTS+儲備液。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，使其在734 nm下的吸光度在0.70±0.02。在一系列比色管中，分別加入4 mL ABTS+工作液，再分別加入40 μL不同濃度的Trolox標準品溶液，準確振蕩30 s，測定反應6 min后734 nm波長下的吸光度。繪制吸光度與Trolox標準品溶液濃度的標準曲線。取4 mL的ABTS+工作液置于試管中，加入40 μL樣品待測液，準確振蕩30 s，6 min后測定在734 nm下的吸光度，取3個平行取平均值，記為 A。ABTS+自由基清除率/%=（1-A/0.700）×100。

2 結果與分析

2.1 4種單因素對仙人掌熱水浸提法的影響

2.1.1 時間對提取率的影響

按照方法1.3.2.1探究不同提取時間條件對ODP的提取率的影響，結果見圖1。

圖1 提取時間對ODP提取率的影響Fig.1 Effect of time on the polysaccharides content

如圖1所示，提取率隨著時間的增加而增加，到2h時達到了一個峰值0.162%，多糖濃度為53.46 μg/mL，隨后提取率雖有略微提升，但變化率不明顯，趨于平緩。可能是由于時間過長會使ODP本身結構分解導致提取率降低，本著工藝低成本和高提取率的原則，選擇1.5、2、2.5 h作為響應面試驗水平。

2.1.2 溫度對提取率的影響

按照方法1.3.2.2探究不同提取溫度條件對ODP的提取率的影響，結果見圖2。

圖2 提取溫度對ODP提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the polysaccharides content

如圖2所示，提取率隨著溫度的增加變化率顯著，在溫度為60℃時達到了峰值0.171%，多糖濃度為56.43 μg/mL，隨后提取率隨著溫度的升高而降低，在80℃后變化開始趨于平緩。可能是一定溫度下會促進ODP的溶出，過高溫度會破壞本身結構導致提取率降低，因此，選擇55、60、65℃作為響應面試驗水平。

2.1.3 液料比對提取率的影響

按照方法1.3.2.3探究不同提取液料比對ODP的提取率的影響，結果見圖3。

如圖3所示，ODP提取率隨著液料比的增加而增加，在液料比為20∶1（mL/g）時達到了峰值0.139%，濃度為45.87μg/mL，隨后提取率隨著液料比的升高而降低，在液料比35∶1（mL/g）后變化開始趨于平緩。說明溶劑液料比對提取率有顯著的影響。因此，選擇15∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）作為響應面試驗水平。

圖3 提取液料比對ODP提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on the polysaccharides content

2.1.4 pH值對提取率的影響

按照方法1.3.2.4探究不同提取pH值對ODP的提取率的影響，結果見圖4。

圖4 提取pH值對ODP提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the polysaccharides content

如圖4所示，ODP提取率隨著pH值的變化波動甚微，總體趨于平緩，只在pH值過酸和過堿出現了先降后升的情況，而在緒論中論述酸堿環境對多糖的結構影響中提到過，過酸、過堿情況下都會一定程度對多糖的結構有損傷，故而，在響應面試驗上不將pH值作為一個水平。

2.2 響應面優化仙人掌熱水浸提法工藝

2.2.1 響應面結果方差分析

根據上述4個單因素試驗結果分析，可見其中溫度、時間、液料比3個因素對提取ODP有著顯著的影響，使用Design-Expert.8.05試驗設計見表2，對試驗結果進行回歸擬合得到響應面分析結果見圖5至圖7，得到回歸方程：

Y=0.094+0.000 5X1+0.002 25X2+0.004 5X3-0.022X1X2+0.001 75X1X3-0.016X2X3-0.025X12+0.009 575X22-0.012X32，回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性，由F檢驗來判定，P值（F＞Fα）越小，則相應變量的顯著程度越高。從回歸分析結果（見表3）可以看出，各因素中X12在10%顯著水平下可認為顯著，其它因素不是極顯著，而且 F（X3）＞F（X2）＞F（X1）。方差模型（R2=0.998 5）R值越接近1.0，說明試驗值與預測值的相關性越好。對回歸方程取一階偏導數等于零，整理如下：

表2 仙人掌熱水浸提工藝響應面試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix with experimental and predicted values on the yield of ODP

圖5Z=f（X1，X3）的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface and contour of Z=f（X1，X）

圖6Z=f（X1，X2）的響應曲面和等高線Fig.6 Response surface and contour of Z=f（X1，X2）

圖7Z=f（X2，X3）的響應曲面和等高線Fig.7 Response surface and contour of Z=f（X2，X3）

式（1）（2）（3）聯立方程組，解得 X1=0.003 62，X2=0.027 96，X3=0.169 12，將X1X2X3帶回回歸方程得試驗理論結果，為0.094 41%，驗證模型的可靠性，課題中采用最佳提取工藝：提取溫度為64.25℃，提取時間為 1.5 h，提取液料比為 22.38∶1（mL/g），在此條件下進行平行試驗3次，實際得率為（0.114 2±0.027 3）%，預測值為0.114 8%與預測值誤差為0.026 7%，與BBD預測值基本一致。因此，采用RSM優化得到的提取工藝參數可靠性佳。

表3 仙人掌多糖得率的回歸方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation for yield of ODP

2.2.2 響應圖分析因素間的交叉關系

將模型中的某一因素固定在零水平作響應面圖可獲得另外兩個因素的交互作用圖。圖形的響應曲面及其等高線圖的形狀可以反映交互效應的強弱（如圖5、6、7）。響應面的拋物面開口向下，且有極大值點，說明所選因素水平里包括了最優組合[22]。等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則說明交互作用不顯著。比較3組圖可知：溫度比對仙人掌多糖浸提的影響最為顯著，表現為曲線較陡；而提取時間與料液比次之，表現為曲線較為平滑，且隨其數值的增加或減少，響應值變化較小。

2.3 水提ODP抗氧化活性研究

配置不同濃度VC溶液作為陽性對照，分別采用了DPPH自由基、羥自由基、ABTS+自由基清除方法測定抗氧化性為仙人掌粗多糖溶液做參考。結果見圖8、圖9、表4。

圖8 VC對3種自由基清除能力比較Fig.8 The compare about three kinds of radical scavenging ability of VC

圖9 ODP對3種自由基清除能力比較Fig.9 The compare about three kinds of radical scavenging ability of ODP

表4 IC50結果Table 4 Results of IC50 mg/mL

由表4對比可以看出，仙人掌多糖對3種自由基均具有清除能力。隨著ODP的濃度的升高，對DPPH自由基的清除率在增加，ODP濃度達到6.4 mg/mL前，對DPPH的清除率增幅明顯，在6.4 mg/mL后增速逐漸趨于平緩，濃度達到25.6 mg/mL時清除率為90.03%。ODP對羥自由基的清除率曲線較DPPH自由基清除率曲線趨勢更平緩，在濃度12.8mg/mL前清除率變化率大于濃度12.8 mg/mL后的清除率。ODP對ABTS+自由基的清除率如圖所示，當濃度由0.8 mg/mL升至3.2mg/mL時，清除率變化明顯，在濃度由3.2mg/mL至12.8 mg/mL時，清除率隨著濃度的增加而增加，增速平衡，在ODP濃度達到12.8 mg/mL后，清除率沒有明顯的變化，趨于平緩，在最后的區間內清除率又瞬間有了增幅。由此可看出ODP對ABTS+自由基也有顯著的清除效果，但清除效果隨著ODP濃度的增加變化趨勢不穩定。從表4中我們可以看出，DPPH自由基的IC50值小于羥自由基和ABTS+自由基的IC50值，說明ODP對DPPH自由基的清除能力強于另外兩種自由基的清除能力。其中，羥自由基清除率的IC50值最大，說明ODP對羥自由基的清除率最弱。

3 結論與討論

本課題探索的熱水浸提新鮮仙人掌多糖的響應面優化最佳提取工藝為提取溫度64.25℃，提取時間1.5 h，提取液料比 22.38 ∶1（mL/g），pH 值為 7，最優得率為 （0.114 2±0.027 3）%，ODP 濃度為 （37.686±9.009）μg/mL，相對于其他文獻的多糖得率偏低，主要是因為提取率計算基數的不同，本課題直接使用新鮮仙人掌莖提取，提取率基數是新鮮仙人掌重量，而采用仙人掌干粉提取的文獻中提取率基數是干粉重量，所以造成數據相差較大。

本課題探究了醇沉后粗多糖的抗氧化性。分別采用了DPPH自由基、羥自由基、ABTS+自由基清除方法，結果顯示仙人掌多糖ODP對3種自由基均有良好的清除作用，且對3種自由基清除的能力為：DPPH自由基＞ABTS+自由基＞羥自由基。研究中發現簡潔預處理下的仙人掌多糖得率雖然低，但是抗氧化活性相對于已有的抗氧化活性研究成果中，抗氧化性能更佳。

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Extracting Conditions and Antioxidant Activities of the Polysaccharides Extracted from Fresh Opuntia dillenii

YU Dan1，XIE Ya-fei1，SU Ning2，AN Quan3，ZHAO Dan1，WANG Chang-tao1，LI Meng1，*
（1.School of Science，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.Cosmetic Center，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China；3.Yunnan Baiyao Group Co.，Ltd.，Kunming 650500，Yunnan，China）

2017-07-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.007

中國檢驗檢疫科學研究院基本科研業務費裝箱資金資助項目（2015JK015）；質檢公益性行業科研專項項目（201310132）；質檢公益性行業科研專項項目（201410019）

虞旦（1993—），女（漢），碩士研究生在讀，研究方向：化妝品原料。

*通信作者：李萌，女，副教授，博士，研究方向：化妝品原料。