響應面分析法優化山楂多糖的提取工藝

李丹丹，周杰，牟德華，李艷，曹燦，王巍

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北冠卓檢測科技有限公司，河北石家莊050000）

響應面分析法優化山楂多糖的提取工藝

李丹丹1，周杰2，牟德華1，李艷1，曹燦1，王巍1

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北冠卓檢測科技有限公司，河北石家莊050000）

以山楂為原料，對山楂多糖的影響因素及工藝進行優化研究。采用熱水浸提方法，分析提取時間、溫度、液料比對提取山楂多糖的影響。采用硫酸-苯酚法測定山楂多糖，根據響應面進行優化分析，確定山楂多糖的最優提取條件為：液料比25∶1（mL/g）、提取溫度90℃、提取時間93 min。該條件下山楂多糖的得率為53.77%。該提取工藝操作簡單，穩定性好，適用于工業化生產。

山楂；多糖；提取工藝；響應面分析法

Abstract：The extraction process for polysaccharide in hawthorn was optimized.With water as extraction solvent，the effect of extraction time，extraction temperature and liquid-solid ratio on the yield of polysaccharide were optimized with single factor test followed by response surface methodology.The results of optimal extraction conditions for polysaccharide was given.The solid-liquid ratio was 25∶1（mL/g），temperature was 90℃，the extraction time was 93 min.Under this condition，the extraction yield of hawthorn polysaccharide was 53.77%.The extraction process was simple and reasonable，suitable for industrial production.

Key words：hawthorn；polysaccharides；extraction process；the response surface methodology

山楂為薔薇科蘋果亞科落葉灌木山里紅和北山楂的干燥成熟果實。山楂果實中含有糖類、氨基酸類、黃酮類化合物、黃烷及其聚合物類、三萜類化合物和有機酸類等多種化學成分[1-3]，具有抗氧化、降壓、降血脂、防癌、抗菌消炎等方面功效，是一種藥食兼用的水果[4-5]。

多糖作為生命有機體的重要組成部分，對維持生命所需的多種生理功能有很重要的意義。目前對多糖的研究可知，多糖具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等一系列的生物活性[6-10]，這對于藥物的研發和食品的加工很有幫助，所以近年來，功能性多糖的研究越來越受到受關注。本研究以山楂為研究對象，以水溶性多糖得率為指標，對山楂多糖的提取工藝進行了單因素試驗和響應面優化，探討其多糖提取最佳工藝條件，為深入開發山楂資源提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

鮮山楂：河北省興隆縣大果山楂。

1.1.2 試劑

葡萄糖（AR）：天津市百世化工有限公司；濃硫酸（AR）：新光化工試劑廠；苯酚（AR）：天津市大茂化學試劑廠。

1.1.3 儀器

KQ5200DE型數控超聲波清洗器：中國江蘇昆山市超聲儀器有限公司；JJ1000型精密電子天平：美國雙杰兄弟集團有限公司；101-OAB型電熱鼓風干燥箱：中國天津市泰斯特儀器有限公司；V-5000可見分光光度計：上海市元析儀器有限公司；QL-901型渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理

將鮮山楂果洗凈，去核、切成薄片后在50℃下干燥至恒重，研磨過120目篩子，稱重備用。

1.2.2 多糖提取工藝路線

準確稱取4.00 g山楂粉，按一定的液料比加蒸餾水，恒溫水浴浸提，抽濾取濾液，用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.2.3 多糖的測定

分別移取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的葡萄糖標準液，分別置于6支潔凈的試管中，加入蒸餾水補充至2 mL，按順序依次加入1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，分別迅速加入濃硫酸5 mL，用渦旋振蕩器搖勻，室溫靜置10 min，然后20℃水浴20 min。以不加葡萄糖標準溶液的試管作為對照，在波長為490 nm處測定其它試管的吸光度。以葡萄糖標準溶液的質量濃度為X軸，測得的吸光度為Y軸，繪制葡萄糖的標準曲線。直線方程為y=0.013 3x+0.066 8（R2=0.999）。

先將山楂多糖的提取液分別吸出0.2mL于100mL的容量瓶中定容、搖勻，在從稀釋后的液體中分別取出2 mL于潔凈的試管中，按順序依次加入1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，分別迅速加入濃硫酸5 mL，用渦旋振蕩器搖勻，室溫靜置10 min，然后20℃水浴20 min，在波長為490 nm處測定其它試管的吸光度。

1.2.4 山楂多糖得率的計算

式中：C為稀釋后溶液的濃度，μg/mL；V為提取液的體積，mL。

1.2.5 單因素試驗

準確稱取4.00 g山楂粉，加入一定體積蒸餾水，水浴加熱浸提一定時間，抽濾得提取液，用苯酚-硫酸法測定多糖含量。分別以液料比、提取溫度和提取時間3個因素為對象，考察其對山楂多糖得率的影響。

1.2.6 響應面優化設計

采用Design-Expert6.0.10Trial軟件中的響應面試驗設計原理設計響應面試驗。選擇提取時間A、溫度B、液料比C，3個因素作為試驗因素，以山楂總糖得率為響應值，從而確定最佳提取條件。

1.2.7 驗證試驗

為了進一步考察優選工藝的可靠性和穩定性，精密稱取4.00 g山楂粉，在1.2.6確定的工藝條件下進行3次試驗，驗證所提取條件優化的穩定性。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對多糖得率的影響

提取時間對多糖得率影響如圖1所示。

圖1 提取時間對多糖得率的影響Fig.1 The effect of extraction time on the yield of hawthorn polysaccharide

多糖的得率隨著時間的延長呈現上升的趨勢，提取時間為2 h多糖的得率達到最大可以達到50.06%，但是120 min以后延長時間對多糖的得率沒有太大的影響。

2.1.2 提取溫度對多糖得率的影響

提取溫度對多糖得率影響如圖2所示。

圖2 溫度對多糖得率的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the yield of hawthorn polysaccharide

多糖的得率隨著溫度的升高不斷的增加，60℃～80℃，多糖的增加量顯著，80℃之后隨溫度的增加，多糖的增加量變化不明顯。主要是由于用水作為溶劑提取多糖時，隨著溫度的升高，分子的熱運動加劇，分子的擴散速度增加，越來越多的多糖分子進入到水中，所以多糖得率會不斷增加。

2.1.3 液料比對多糖得率的影響

液料比對多糖得率影響如圖3所示。

圖3 液料比對多糖得率的影響Fig.3 The effect of liquid-solid rate on the yield of hawthorn polysaccharide

隨著液料比的增加多糖的得率有一個先增加后趨于平緩的一個趨勢，10（mL/g）～30（mL/g）之間時多糖的得率是逐漸增加的，30（mL/g）之后趨于平緩。這是由于提取劑用量逐漸增大時，有效成分在提取劑中的濃度降低，物料及提取劑邊界層的有效成分濃度差變大，主動擴散力增大，當多糖的溶出量幾乎接近最大時繼續增加提取劑的用量不再起明顯的作用。

2.2 山楂多糖提取響應面法優化分析

2.2.1 優化處理

為了確定提取多糖試驗的最優條件，在響應面分析軟件中設定液料比、提取溫度和提取時間這3個因素的取值范圍如表1，試驗結果見表2。

表1 響應面試驗的因素和水平編碼值Table 1 Coded factors and levels in quadratic regression rotational combinational design

表2 響應面分析的試驗設計和試驗結果Table 2 Response surface analysis design matrix and experimental results

利用響應面分析法對表2的試驗數據進行分析，得到一個擬合二次多項式方程。該二次多項式方程為：得率=-216.840 75+1.880 15A+0.707 83B+9.987 25C-6.068 89×10-3A2+4.605 00×10-3B2-0.169 98×C2-7.541 67×10-3AB-2.916 67×10-3AC-0.011 700×BC

2.2.2 模型方差分析

方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model

由表3可知，該方程模型是顯著的，失擬項比F值不顯著，方程的F值為6.45，P＜0.1，表示該因素對山楂多糖提取量影響是顯著的。由表3可知，A、B、A2、C2項的影響是顯著的，而C、B2、AC、AB和BC項山楂多糖提取量影響是不顯著的。3個試驗條件（A：提取時間；B：溫度；C：液料比）對提取量影響的主次順序為：B＞A＞C。

2.2.3 響應面分析

山楂多糖提取工藝中提取時間、溫度和液料比3個因素之間交互作用對山楂多糖得率的影響見圖4、圖 5、圖 6。

由圖4、圖5、圖6可知，每個因素都有雙向增長，即因素值增大則響應值增大；當因素取值增大到一定值時，響應值達到極值，之后隨著因素的增大，響應值逐漸減小；通過對3個圖形對比來看，溫度（B）對水浴法提取多糖的影響最為顯著。通過對響應面圖的分析得出山楂多糖的最優提取條件為：液料比25∶1（mL/g）、溫度90℃、提取時間93 min，最優條件下多糖的得率為53.77%。

圖4 提取時間和溫度對山楂多糖得率的響應面圖Fig.4 Response surface plot showing the effects of extraction time and temperature on the yield of hawthorn polysaccharide

圖5 提取時間和液料比對山楂多糖得率的響應面圖Fig.5 Response surface plot showing the effects of extraction time and liquid-solid rate on the yield of hawthorn polysaccharide

圖6 提取溫度和液料比對山楂多糖得率的響應面圖Fig.6 Response surface plot showing the effects of extraction temperature and liquid-solid rate on the yield of hawthorn polysaccharide

2.2.4 響應面分析法預測值的驗證

按照響應面軟件得到的最優條件，在最優條件下進行3組平行試驗驗證其可靠性。由響應面分析法可得到優化的試驗條件：液料比25∶1（mL/g）、溫度90℃、提取時間93 min，進行3次平行試驗，測提取多糖得率分別為53.76%、53.78%和53.78%，平均值為53.77%。試驗證明，此工藝穩定，重復性好。

3 結論

利用水提法提取多糖具有能耗低、省時、不破壞有效成分等優點，該工藝合理、成熟，有較高的開發價值。通過單因素試驗以及響應面優化，試驗提取出各因素對山楂多糖提取效果的影響程度為提取溫度＞提取時間＞液料比。確定山楂多糖水提法提取多糖最佳工藝條件為：液料比 25∶1（mL/g）、溫度 90℃、提取時間93 min。

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Optimization of Extraetion of Polysaccharides from Hawthorn Using Response Surface Methodology

LI Dan-dan1，ZHOU Jie2，MOU De-hua1，LI Yan1，CAO Can1，WANG Wei1
（1.College of Bio-engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China；2.Hebei Guanzhuo Detection Co.，Ltd.，Shijiazhuang 050035，Hebei，China）

2016-03-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.010

河北省重點研發計劃（17237103D）

李丹丹（1981—），女（滿），副教授，博士，研究方向：碳水化合物與生物技術研究。