3種大腸埃希氏菌O157：H7篩檢方法的比較

張婧，王利剛，張磊，費云滟，付莎莉，吳丹，陳欣，楊小珊

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶401121）

3種大腸埃希氏菌O157：H7篩檢方法的比較

張婧，王利剛，張磊，費云滟，付莎莉，吳丹，陳欣，楊小珊*

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶401121）

比較mini-VIDAS、膜芯片兩種快速篩檢方法和常規培養法，以確定兩種快速篩檢方法對大腸埃希氏菌O157：H7篩檢的效果。以大腸埃希氏菌O157：H7為目標菌，針對3種方法設計靈敏性、特異性、抗干擾性試驗和人工污染試驗。結果表明，常規培養法和mini-VIDAS法的靈敏性較高，mini-VIDAS法和膜芯片法的特異性和抗干擾性較高，人工污染試驗三者表現符合預期。日常檢驗中可采用國標法和mini-VIDAS法進行篩檢工作，應急檢驗可使用膜芯片法縮短篩檢時間，mini-VIDAS法和膜芯片法可作為初步篩檢的工具使用。

大腸埃希氏菌O157：H7；mini-VIDAS；膜芯片；篩檢

Abstract：This study aimed to compare of two rapid pre-detection methods and traditional culture method for detection ofEscherichia coliO157：H7.Experiments were designed to test the sensitivity，specificity and anti interference of these methods，artificially contaminated samples were tested and verified.The results showed that，traditional culture method and mini-VIDAS method with high sensitivity，mini-VIDAS and membranebased array method with specificity and high anti-interference，artificially contaminate test was as expected.Traditional culture method and mini-VIDAS method can be used for pre-detection in daily inspections，membrane-based array method could shorten the pre-detection time in emergency testing.Additionally，mini-VIDAS and membrane-based array are good tools for pre-detection of theEscherichia coliO157：H7.

Key words：Escherichia coliO157：H7；mini-VIDAS；membrane-based array；pre-detection

大腸埃希氏菌 O157：H7（Escherichia coliO157：H7，E.coliO157）是一種食源性致病菌，是腸出血性大腸埃希氏菌的主要血清型，感染后會出現腹瀉、出血性腸炎等癥狀，進而引發溶血性尿毒綜合征、血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴重并發癥，兩種并發癥的致死率高達30%[1-2]。1982年美國爆發了由E.coliO157導致的流行感染，之后世界各國相繼發生，美國、加拿大、日本等國發病案例較多，1997年，世界衛生組織將E.coliO157列為新的食源性致病菌[3-4]。我國E.coliO157流行多為散發案例，但在江蘇、安徽、河南等地出現過流行爆發的報道[5-7]。為控制食品中E.coliO157污染，預防E.coliO157導致食源性疾病發生，國家衛生計生委對其在食品中的限量進行了規定[8]。

E.coliO157的常規檢驗方法為培養法[9]，操作步驟繁瑣，人員素質要求高，且耗時較長，已經不能滿足現在食品檢測中高通量、短時效的要求。隨著檢驗技術的進步，基于分子技術、免疫學技術的快速篩檢方法[10-13]逐步進入檢驗行業，可靠穩定的技術被開發為商業化的產品。本試驗將VIDAS大腸桿菌O157（ECO）篩選法[14]和膜芯片法兩種快速篩檢方法與常規培養法進行對比，從靈敏性、特異性、抗干擾性等方面進行試驗，評估兩種快速篩檢方法在檢驗工作中的可操作性。

1 試驗材料

1.1 菌株與樣品

大腸埃希氏菌 O157：H7（Escherichia coliO157：H7，CICC 21530）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri，CICC 10865）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，CICC 21636/ATCCR27853TM）：中國工業微生物菌種保藏管理中心；大腸埃希氏菌（Escherichia coli，ATCCR25922TM）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，ATCCR14028TM）、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，ATCCR19115TM）：美國菌種保藏中心。

樣品為實驗室日常檢驗樣品。

1.2 主要儀器

ZDP-2106常規生化培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；mini-VIDAS全自動免疫分析儀：法國生物梅里埃股份有限公司；MFS-8膜芯片雜交儀、IMG-1膜芯片成像儀：四川華漢三創生物科技有限公司。

1.3 主要試劑

常規培養基、大腸桿菌O157顯色培養基：北京陸橋技術股份有限公司；VIDAS大腸桿菌O157（ECO）試劑條：法國生物梅里埃股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；致病微生物檢測芯片：四川華漢三創生物科技有限公司。

2 方法

2.1 3種方法操作步驟

2.1.1 常規培養法

按照GB/T 4789.36-2008《食品衛生微生物學檢驗大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗》第一法檢驗流程，轉接大腸桿菌O157顯色培養基，36℃培養24 h，觀察篩檢結果。

2.1.2 mini-VIDAS法

按照GB/T 4789.36-2008《食品衛生微生物學檢驗大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗》第三法檢驗流程，培養后上機檢驗，檢驗結束后儀器報告并打印篩檢結果。

2.1.3 膜芯片法

接種產品自帶培養基，并按照其要求培養溫度、時間培養后，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌總DNA，使用自帶的PCRMix對提取的DNA進行擴增，擴增產物99℃變性10 min，膜芯片雜交儀進行雜交、洗脫等操作，結束后使用膜芯片成像儀觀察篩檢結果。

2.2 靈敏性試驗

標準菌株大腸埃希氏菌O157：H7接種到改良EC肉湯培養基中，36℃培養24 h，按照1∶10進行梯度稀釋，獲得103CFU/mL～106CFU/mL濃度的菌懸液，不同濃度視作不同方法液體培養基培養物，并分別采用2.1.1、2.1.2、2.1.3 的方法進行篩檢。

2.3 特異性試驗

大腸埃希氏菌O157：H7、福氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌分別進行培養，培養物按照1∶10進行梯度稀釋，獲得105CFU/mL濃度的菌懸液，分別采用2.1.1、2.1.2、2.1.3 的方法進行篩檢。

2.4 雜菌干擾試驗

大腸埃希氏菌O157：H7、福氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌分別進行培養，按照1∶10進行梯度稀釋，以大腸埃希氏菌O157：H7為目標，設定3組混合菌。第一組福氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌的濃度為 103CFU/mL，按照體積比 1∶1∶1∶1∶1混合，第二組5種菌的濃度為104CFU/mL，按照體積比1∶1∶1∶1∶1混合，第三組5種菌的濃度為105CFU/mL，按照體積比1∶1∶1∶1∶1混合。以上混合菌按照體積比1∶1的比例與濃度105CFU/mL大腸埃希氏菌O157：H7混合，同時分別使用濃度105CFU/mL大腸埃希氏菌O157：H7和濃度105CFU/mL混合菌作為陽性和陰性對照，分別采用2.1.1、2.1.2、2.1.3的方法進行篩檢。

2.5 人工污染試驗

收集實驗室檢驗的大腸埃希氏菌O157：H7陰性樣品20批次，其中畜肉制品5批次、禽肉制品5批次、動物內臟制品5批次、蔬菜制品5批次，每批次樣品分為兩組，一組為陽性組，按照每25g樣品添加1mL濃度103CFU/mL大腸埃希氏菌O157：H7的比例進行人工污染，一組為陰性對照組，不進行人工污染，分別采用2.1.1、2.1.2、2.1.3的方法進行篩檢。

3 結果與討論

3.1 靈敏性試驗結果

用3種方法對不同濃度的大腸埃希氏菌O157：H7菌懸液進行靈敏性試驗的結果如表1所示，在常規培養法中，顯色培養基上出現典型菌落的濃度為104CFU/mL，mini-VIDAS法判定陽性的濃度為104CFU/mL，膜芯片法檢出濃度為105CFU/mL，mini-VIDAS法靈敏性高于其他兩者。在常規培養法中采用的顯色培養基選擇性強，因此對靈敏性有一定影響，在顯色培養基上的生長狀態符合其典型菌落特征。mini-VIDAS法基于抗原抗體反應，靈敏性較高，當檢測閾值（TV，test va lue）值大于0.10時，系統判定檢出大腸埃希氏菌O157：H7。膜芯片法通過核酸雜交顯色后觀察是否陽性，但在雜交前還經過了DNA提取、PCR擴增、高溫變性等過程，操作步驟越多對靈敏度的影響越大。

表1 不同檢測方法靈敏性比較Table 1 Comparison of sensitivity of three methods

3.2 特異性試驗結果

常規培養法中，顯色培養基上大腸埃希氏菌O157：H7的生長特征明顯，同菌屬的大腸埃希氏菌也可以有效分離，但是福氏志賀氏菌與大腸埃希氏菌O157：H7生長情況相似，還需進行下一步試驗才能確定。基于抗原抗體特異結合反應的mini-VIDAS法對大腸埃希氏菌O157：H7的特異性較強，除單核細胞增生李斯特氏菌判定陽性外，其他幾種菌的判定均為陰性。膜芯片法針對大腸埃希氏菌O157：H7的eaeA基因設計探針，特異性較好。不同檢測方法特異性比較見表2。

表2 不同檢測方法特異性比較Table 2 Comparison of specificity of three methods

3.3 雜菌干擾試驗結果

按照2.4的設計，干擾菌的總濃度水平為104、105、106CFU/mL，分別處于高于、相當、低于大腸埃希氏菌O157：H7的濃度水平，陽性對照和陰性對照的結果顯示3種方法的操作正常。常規培養法中在3個設計中均有典型菌落生長，但由于其中有其他干擾菌的存在，故無法直接判定，還需進一步試驗才能確定，同時由于雜菌存在，進行鑒定時應該選擇多個菌落進行鑒定，以防發生漏檢的情況。Mini-VIDAS法的篩檢結果均為陽性，陰性對照結果為陰性，顯示了該方法的特異性較強。膜芯片法在干擾菌濃度低或者相當時檢出，干擾菌濃度高時未檢出的原因分析為，DNA提取后總DNA濃度不變，但是目標菌的DNA濃度相對降低，影響判定結果。不同檢測方法抗干擾性比較見表3。

表3 不同檢測方法抗干擾性比較Table 3 Comparison of anti-interference of three methods

3.4 人工污染試驗

人工污染試驗中，常規培養法對于陽性組的篩檢效率為100%，仍需進行下一步試驗；對陰性組的篩檢效率為5%，其中有1批次牛肉有典型菌落，進一步試驗后確定非腸埃希氏菌O157：H7。mini-VIDAS法對于陽性組篩檢效率為100%，對陰性組篩檢效率為0%，完全符合人工污染設計。膜芯片法對于陽性組篩檢效率為100%，但是陽性結果觀察顯色程度不同，個別顯色較淺，肉眼幾乎無法分辨，借助膜芯片成像儀可見顯色，分析原因為增菌過程中由于雜菌較多大腸埃希氏菌O157：H7未形成優勢菌株，進而影響以后的一系列操作，符合預期。人工污染試驗篩檢結果比較見表4。

表4 人工污染試驗篩檢結果比較Table 4 Comparison of the screening for artificially contaminated samples

4 結論

從兩種快速篩檢方法與常規培養法的比較結果可以看出，常規培養法的靈敏性較優，但是某些細菌在顯色培養基上的生長狀態與目標菌相似，使其特異性和抗干擾性受到一定影響；mini-VIDAS法在特異性、靈敏性和抗干擾上表現良好，可作為較好的篩選方法應用到檢驗工作中；膜芯片法的特異性較好，但是該方法要從菌株水平轉換到分子水平，操作人員的熟練程度對其靈敏性有一定的影響。實際操作中3種方法的篩檢時間差異較大，常規培養法為78 h，mini-VIDAS法為30 h，膜芯片法為14 h。綜合以上情況，建議日常檢驗中可以采用國標法和mini-VIDAS法進行篩檢工作，對于應急任務可使用膜芯片法縮短篩檢時間，同時用mini-VIDAS法進行驗證，確保試驗結果的準確。

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Comparison of Three Pre-detection Methods for Detection of Escherichia coli O157：H7

ZHANG Jing，WANG Li-gang，ZHANG Lei，FEI Yun-yan，FU Sha-li，WU Dan，CHEN Xin，YANG Xiao-shan*
（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

2017-01-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.024

重慶市社會民生科技創新專項項目（cstc2015shmszx 00002）；重慶市科技計劃項目（cstc2015jcsf8001）

張婧（1985—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食源性致病菌檢驗。

*通信作者：楊小珊（1975—），女（漢），高級工程師，博士，研究方向：食品安全與監管。