黃酒酒曲中產生物胺細菌的分離鑒定

胡翠翠，李秋妍，朱曉娟，李長庚，齊星，張穎，張健，*

（1.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

黃酒酒曲中產生物胺細菌的分離鑒定

胡翠翠1，李秋妍1，朱曉娟1，李長庚1，齊星1，張穎2，張健1，*

（1.工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

為探明黃酒酒曲中產生物胺細菌的菌相，深入研究黃酒中的生物胺形成機制，分別以4種黃酒酒曲（麥曲M、麥曲L、小曲Q、紅曲H）為研究對象，采用脫羧酶培養基對產生物胺細菌進行初篩，高效液相色譜法復篩，并通過16S rDNA基因序列分析，對分離得到的產生物胺細菌進行鑒定。共篩選出42株產生物胺細菌，包括腸桿菌屬（Enterobactersp.）17株，乳桿菌屬（Lactobacillussp.）6株，克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）5株，沙門氏菌屬（Salmonellasp.）4株，腸球菌屬（Enterococcussp.）3 株，克羅諾菌屬（Cronobactersp.）3株，埃希菌屬（Escherichiasp.）菌株 2 株，檸檬酸桿菌屬（Citrobactersp.）1株，葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）1株。分離的產生物胺細菌中多數可同時產生多種生物胺，其中產腐胺、尸胺、組胺的菌最多，但未分離到色胺和亞精胺產生菌。

黃酒；生物胺；酒曲；細菌；分離；鑒定

Abstract：In order to explore the bacterial phase of biogenic amines（BAs）-producing bacteria in Chinese rice wine Qu，so as to further study the formation mechanism of BAs in Chinese rice wine，potential BAs producers were isolated and screened using a decarboxylase broth from four kinds of rice wine Qu，including wheat Qu（M），wheat Qu（L），Xiao Qu（Q）and Hong Qu（H）.The presence of BAs from bacterial broth was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）.BAs producers were identified by comparison of their 16S rDNA gene sequences with those included in the NCBI Databases.Forty-two BAs-producing bacteria were identified，including 17Enterobactersp.strains，6Lactobacillussp.strains，5Klebsiellasp.strains，4Salmonellasp.strains，3Enterococcussp.strains，3Cronobacteriumsp.strains，2Escherichiasp.strains，1Citrobactersp.strain and 1Staphylococcussp.strain.Many BAs-producers could produce more than one BAs，and most of them could produce putrescine，cadaverine and histamine，but none of them could produce tryptamine and spermidine.

Key words：Chinese rice wine；biogenic amines；rice wine Qu；bacteria；isolation；identification

黃酒是世界上最古老的酒類之一，是我國的民族特產。該酒種通常是以谷物為原料，經過蒸料，拌以酒曲或酒藥，進行糖化和發酵釀制而成。其特有的開放式多菌種發酵造就了黃酒酒體風味醇厚、豐滿、完整和馥香的特點，但發酵過程復雜且難以控制，極易產生生物胺[1]。相比其它發酵酒，黃酒中的生物胺含量更高，平均含量高達115 mg/L[2]。適量的生物胺在生物體內具有重要的生理作用，但是，當人體吸收過量的生物胺時，將產生一系列應激反應，可能引起頭痛、呼吸紊亂、心悸等不良癥狀，嚴重情況下，可以引起大腦出血，甚至死亡[3]。雖然目前缺乏黃酒中生物胺的限量標準，但共識是應努力減少其中生物胺含量，從而降低黃酒攝入風險[4]。

生物胺主要是由氨基酸經脫羧酶類催化的脫羧反應產生的，也有部分是通過醛或酮的胺化和轉胺作用形成的[5]。根據生物胺的合成機制，黃酒中生物胺的合成需要3個條件[6]：存在游離氨基酸，存在能夠產生氨基酸脫羧酶的微生物，具備相應微生物生存、產酶、合成生物胺的環境因素。游離氨基酸主要來源于谷物原料，而產生氨基酸脫羧酶的微生物主要源于酒曲、原料和環境。其中酒曲尤為重要，不同的制曲原料和工藝造就了酒曲中特有的微生物種群結構，這在很大程度上決定了黃酒的風味和口感，以及其中的生物胺種類和含量。對黃酒酒曲中的生物胺產生菌進行分離鑒定，是深入研究黃酒中生物胺形成機制的必要前期基礎，有助于理解不同酒曲釀造黃酒中生物胺含量的差異。

產生物胺細菌的分離通常有3類方法：微生物學、化學和分子生物學方法。微生物學方法[7]是根據產生物胺菌株的生理特征及其生長過程中的生化變化，采用特異性選擇培養基來進行篩選、鑒別，此方法誤差大，只適合于初篩；化學法，即利用各種測定生物胺的化學手段測定菌株培養液中生物胺的含量?；瘜W法不僅可以定性判定產生物胺的菌株，而且還可以定量評價其生物胺的產生能力。分子生物學方法，根據目前已知的氨基酸脫羧酶的氨基酸保守序列設計特異性引物，通過PCR擴增來鑒別。

產生物胺細菌的鑒定，主要有表型特征和基因型鑒定兩種方法。前者是基于菌株形態學及生理生化特征的鑒定；后者是針對菌株16S rDNA序列同源性比對。很多情況下不同菌株的形態或生理生化差異極不顯著，而且形態特征有時還會受環境因素的影響，因此基于表型特征的鑒定常不準確。目前的主流方法是表型特征結合基因型的多相鑒定方法，通過該方法可將菌株鑒定到種。

目前，國內外尚未見分離鑒定黃酒酒曲中生物胺產生菌的報道，但已有從浸米水中分離鑒定生物胺產生菌的報道[8]。本研究將以4種黃酒酒曲（麥曲M、麥曲L、小曲Q、紅曲H）為研究對象，采用脫羧酶培養基初篩、高效液相色譜復篩的方法來分離其中的產生物胺細菌，并通過16S rDNA序列同源性比對來初步鑒定這些菌株，旨在探明黃酒酒曲中產生物胺細菌的菌相，為后續黃酒中生物胺的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 酒曲

麥曲M、麥曲L、小曲Q、紅曲H：為不同黃酒生產企業提供。

1.1.2 主要試劑

尸胺（色譜純）：美國Sigma公司；色胺、苯乙胺、腐胺、組胺、酪胺、亞精胺（色譜純）：美國Genview公司；乙腈（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；丹磺酰氯、L-組氨酸鹽酸鹽、色氨酸、酪氨酸（分析純）：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基：北京奧博生物科技有限責任公司；鳥氨酸鹽酸鹽（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；賴氨酸、溴甲酚紫、磷酸吡哆醛、硫胺素（分析純）：美國Genview公司；DNA marker：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；2×Taq PCR Master Mix：博邁德生物科技有限責任公司；PCR引物：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器與設備

Sorvall Legend Micro 17/17R冷凍離心機、ProFlex 3 x 32 well PCR system三頭PCR儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津公司；海能HN200多功能氮吹儀：北京博雅創新科技發展有限公司；瓊脂糖水平板電泳儀：北京六一公司。

1.2 培養基配方

LB液體培養基（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化鈉10.0，pH 7.0，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。

液體脫羧酶培養基（g/L）[9]：在參考文獻[9]的基礎上加以改良，具體為胰蛋白胨5.0，酵母粉5.0，牛肉膏5.0，葡萄糖 0.5，氯化鈉 2.5，Tween-80 1 mL，檸檬酸銨2.0，K2HPO42.0，MnSO40.2，MgSO40.2，FeSO40.04，Ca－CO30.1，硫胺素0.01，磷酸吡哆醛0.05，溴甲酚紫0.06，賴氨酸5.0，鳥氨酸鹽酸鹽5.0，L-組氨酸鹽酸鹽2.0，色氨酸 2.0，酪氨酸 1.0，放線菌酮 0.05，pH 5.3，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

固體脫羧酶培養基（g/L）：瓊脂粉18.0，其它成分同液體脫羧酶培養基，pH 5.3，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.3 生物胺產生菌的分離

1.3.1 富集培養

取黃酒曲M、L、Q、H各1 g，分別接種于滅菌的100 mL LB液體培養基中，37℃培養4 h。

1.3.2 初篩

將富集培養后的菌液用無菌生理鹽水進行稀釋，取各個梯度的稀釋液100 μL于固體脫羧酶培養基上進行涂布，于37℃恒溫培養箱中培養2 d。挑取紫色陽性菌落并編號，接種于固體MRS試管，于37℃培養16 h后置于4℃冰箱保存。

1.4 高效液相色譜復篩

將初篩菌株接種于液體脫羧酶培養基中，37℃培養4 d。對其發酵液進行HPLC檢測。

1.4.1 標準溶液的制備

準確稱取生物胺各50 mg，用丙酮配制成1 mg/mL的儲備液備用。分別取以上標準品儲備液1 mL，用丙酮配制成終濃度分別為 1.0、2.5、5.0、10、15、25、50 mg/L的混合標準溶液，鋁箔包住，4℃避光保存備用。

1.4.2 標準溶液的前處理

取1 mL各梯度的標準溶液于10 mL離心管中，加入1 mL丹磺酰氯溶液、1 mL飽和NaHCO3溶液，渦旋混勻，60℃水浴30 min，每隔10 min開蓋放氣搖勻。待溶液溫度降至室溫后，加入100 μL氨水，混勻，60℃水浴15 min，取出冷卻至室溫。向其中加入3 mL乙醚進行萃取，待渦旋混勻后靜置1 h，吸取上層有機層于新的離心管中，向下層溶液中重新加入3 mL乙醚，重復萃取2次。對所收集的上層液進行60℃氮吹，待吹干后，向離心管中加入1 mL乙腈，晃動使乙腈充分接觸離心管壁，用0.22 μm的有機膜過濾[10]。

1.4.3 樣品的前處理

把培養4 d的液體脫羧酶培養液進行12 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液加入10 mL離心管中，再加入1 mL丹磺酰氯溶液、1 mL飽和NaHCO3溶液，進行衍生。衍生、萃取步驟同標準溶液。

1.4.4 色譜分析

色譜條件：GEMINI C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國 phenomenex公司），檢測波長 254 nm，進樣量20 μL，柱溫30℃，流速1 mL/min。流動相A為超純水，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序為：0～1 min，B=65%（體積分數）；1 min～10 min，B=80%（體積分數）；10 min～15 min，B=90%（體積分數）；15 min～25 min，B=90%（體積分數）；25 min～30 min，B=65%（體積分數）。外標法定量。

1.5 產生物胺細菌的16S rDNA鑒定

上 游 引 物 為 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物為 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[11]。反應體系為 25 μL 包含：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.5 μL（10 μM） 上游/下游引物，11.5 μL ddH2O，用無菌的槍頭輕輕蘸取單菌落后在體系中輕輕攪拌幾下。反應條件為：95℃，5 min，一個循環；94 ℃、45 s，55 ℃、45 s，72 ℃、90 s，35 個循環；72 ℃，10 min，一個循環。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證成功后送樣測序，把測序結果在NCBI上進行相似性比對，確定該菌株的種屬。

2 結果與分析

2.1 固體脫羧酶培養基初篩

典型的脫羧酶平板篩選結果如圖1所示。

圖1 典型的脫羧酶平板分離結果Fig.1 Representative isolation result in decarboxylase plate

通過初篩共得到42株疑似產生物胺細菌，其中由M中得到9株菌，編號為M1-M9；由L中得到10株菌，編號為L1-L10；由Q中得到6株菌，編號為Q1-Q6；由H中得到17株菌，編號為H1-H17。

2.2 HPLC檢測復篩

為了確認陽性菌株，采用HPLC法檢測42株菌發酵液中的生物胺含量，結果如表1所示。

表1 分離菌株發酵液中生物胺的含量Table 1 BAs content in decarboxylase broth mg/L

續表1 分離菌株發酵液中生物胺的含量Continue table 1 BAs content in decarboxylase brothmg/L

初篩的42株菌均能產生生物胺，但均不產生色胺和亞精胺。產腐胺、尸胺和組胺的細菌最為常見，且很多菌株可以同時產生多種生物胺，僅有少量的菌株產苯乙胺和酪胺。具體來說，從麥曲M中篩出來的菌M1-M9都產腐胺和尸胺，其中有個別幾株還產組胺。而從L中篩出的菌株L1-L10所產的生物胺種類和含量差距較大，其中有3株L5，L6，L8最為特殊，只產苯乙胺和酪胺，并不產腐胺，尸胺和組胺，L1，L2，L3，L7，L10都產大量的腐胺，而產尸胺和組胺的量相對較少，L4和L9則會產生大量的尸胺。從紅曲H中所篩得的17株菌H1-H17，主要產腐胺和尸胺，個別菌株會產生相對較少量的組胺，其中 H1，H2，H4，H5，H7，H8，H9，H10，H11，H13，H14，H15，H17 會產大量的腐胺，其余菌株則產大量尸胺。從小曲Q中共篩得6株菌，這6株菌產生物胺量較低，且除了Q1會產少量酪胺，其它均只產少量的苯乙胺。

2.3 菌株鑒定結果

將測得的16S rDNA基因序列通過網絡與NCBI數據庫序列進行同源性分析，結果如表2所示。

表2 產生物胺細菌的鑒定結果Table 2 Identification of the BAs-producers

42株產生物胺細菌，包括腸桿菌屬（Enterobactersp.）17 株，乳桿菌屬（Lactobacillussp.）6 株，克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）5 株，沙門氏菌屬（Salmonellasp.）4株，腸球菌屬（Enterococcussp.）3株，克羅諾菌屬（Cronobactersp.）3 株，埃希菌屬（Escherichiasp.）菌株2株，檸檬酸桿菌屬（Citrobactersp.）1株，葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）1株，腸桿菌屬為黃酒酒曲中主要的產生物胺細菌。4種曲中，小曲釀酒相對安全性更高，其中的產生物胺細菌均為乳桿菌屬，且產生生物胺含量很少。這可能與小曲相對精細的制作環境有關。麥曲和紅曲中的產生物胺細菌種類很多，這說明麥曲和紅曲在制作和儲存中可能受到了更多的污染，而且其中有些菌屬（如：克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬）中的很多菌種都有致病的可能，這對黃酒的產品安全性構成了嚴重的威脅。

鑒于菌株較多，本研究只采用針對16S rDNA基因序列的分子鑒定方法，但由于16S rDNA序列的長度有限，通常認為該方法鑒定到屬比較可靠，而只有部分能鑒定到種的水平?？梢越Y合其它的生理生化實驗，或微生物鑒定系統來進一步鑒定菌株。

3 結論

黃酒酒曲中產生物胺細菌的種類很多，此次發現的有腸桿菌屬，乳桿菌屬，克雷伯氏菌屬，沙門氏菌屬，腸球菌屬，克羅諾菌屬，埃希菌屬，檸檬酸桿菌屬和葡萄球菌屬。腸桿菌屬是酒曲中主要的產生物胺細菌，個別菌屬菌種對人有潛在的致病性。在本試驗條件下，很多產生物胺細菌可產生多種生物胺，但未分離到色胺和亞精胺產生菌。試驗結果反映出小曲的制作和儲藏過程中，環境的衛生條件較好，細菌污染較少。小曲釀酒相對安全性更高，原因有二，一是乳桿菌屬細菌是公認的安全菌株，二是在本試驗的發酵條件下，這些乳桿菌產生的生物胺含量較低。

黃酒釀造時生物胺含量受原料、工藝、環境條件和多菌種互作等因素的影響，本試驗的結果并不能反映黃酒中的生物胺含量。但酒曲是黃酒之魂，本研究為探究不同黃酒中生物胺的差異，對建立酒曲和成品酒中生物胺的聯系提供了理論參考。

[1]張鳳杰,薛潔,王異靜,等．黃酒中生物胺的形成及其影響因素[J]．食品與發酵工業,2013,39(2):62-68

[2]Zhong J J,Ye X Q,Fang Z X,et al．Determination of biogenic amines in semi-dry and semi-sweet Chinese rice wines from the Shaoxing region[J]．Food Control,2012,28(1):151-156

[3]Caston J C,Eaton C L,Gheorghui B P,et al．Tyramine induced hypertensive episodes,panic attacks in hereditary deficient monoamine oxidase patients:case reports[J]．Journal of the South Carolina Medical Association,2002,98(4):187-192

[4]Ladero V,Fernández M,Alvarez M A．Effect of post-ripening processing on the histamine and histamine-producing bacteria contents of different cheeses[J]．International Dairy Journal,2009,19(12):759-762

[5]Zolou A,Lokou Z,Souflero E,et al．Determination of biogenic amines in wines and beers by high performance liquid chromatography with pre-column dansylation and ultraviolet detection[J]．Chromatographia,2003,57(7/8):429-439

[6]Stute R,Petridis K,Steinhar H,et al．Biogenic amines in fish and soy sauces[J]．European Food Research and Technology,2002,215(2):101-107

[7]Bover-Cid S,Holzapfel W H．Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria[J]．International Journal of Food Microbiology,1999,53:33-41

[8]欒同青．黃酒釀造過程生物胺變化規律及其產生菌株研究[D]．濟南:齊魯工業大學,2003

[9]Mi C,Hae Choon C．Development of a screening method for biogenic amine producing Bacillus spp[J]．International Journal of Food Microbiology,2012,153(3):269-274

[10]中華人民共和國衛生部,中國國家標準化管理委員會．GB/T 5009.208-2008食品中生物胺含量的測定[S].北京:中國標準出版社,2008

[11]Antonella C,Enrico V,Vinenzo D P,et al．Biogenic Amine Production by Contaminating Bacteria Found in Starter Preparations Used in Winemaking[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(22):10664-10669

Isolation and Identification of Biogenic Amine-Producing Bacteria in Chinese Rice Wine Qu

HU Cui-cui1，LI Qiu-yan1，ZHU Xiao-juan1，LI Chang-geng1，QI Xing1，ZHANG Ying2，ZHANG Jian1，*
（1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

2017-01-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.037

國家自然科學基金資助項目（31471725）；天津科技大學大學生實驗室創新基金資助項目（1614A216）

胡翠翠（1990—），女（漢），碩士研究生，主要從事發酵食品安全方面的研究。

*通信作者：張?。?978—），男（漢），副研究員，博士，主要從事發酵食品安全方面的研究。