全蝎保健酒的增強(qiáng)免疫力功能研究

范治云，曲見松，李志坤，趙艷霞，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

全蝎保健酒的增強(qiáng)免疫力功能研究

范治云，曲見松，李志坤，趙艷霞，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101）

研究全蝎保健酒對(duì)小鼠免疫功能的影響。將SPF級(jí)ICR雄性小鼠200只隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分為空白對(duì)照組、溶媒對(duì)照組、低、中、高劑量組（0.85、1.7、5.1 g/kg·bw）5組。空白對(duì)照組給予純化水，溶媒對(duì)照組給予15%的酒基，連續(xù)灌胃30 d，每日1次。檢測(cè)全蝎保健酒對(duì)刀豆蛋白A（Concanavalin A）誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、血清溶血素水平、抗體生成細(xì)胞數(shù)、小鼠碳廓清能力、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力及NK細(xì)胞活性等免疫指標(biāo)的影響。與溶媒對(duì)照組比較，全蝎保健酒高劑量組能顯著增強(qiáng)小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力（P＜0.05），能明顯促進(jìn)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（P＜0.05），能顯著提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)水平（P＜0.05）；高、中劑量組可顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞活性（P＜0.05）；但全蝎酒各劑量組對(duì)小鼠胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、血清溶血素水平、碳廓清能力及巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞作用無明顯影響（P＞0.05）。全蝎保健酒具有增強(qiáng)小鼠免疫力的功能。

全蝎保健酒；免疫功能；小鼠

Abstract：To study the impact of Quanxie health-care wine on immunity function in mice.A total of 200 SPF ICR male mice were randomly divided into 5 batches，each of which consisted of negative control group，vehicle control group and high，medium and low dosage （0.85，1.7，5.1 g/kg·bw）of Quanxie health-care wine group.The negative control group was given purified water，the vehicle control group was given 15%wine base，and each mouse was orally administered once a day，for 30 days.The immune indexes including ConA-induced lymphocyte transformation ability，delayed type hypersensitivity，serum hemolysin level，antibody producing cell count，carbon clearance ability，macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes capacity and NK cell activity were detected.Compared with the vehicle control group，high dosage of Quanxie health-care wine group could significantly strengthen the ConA-induced lymphocyte transformation ability of mice （P＜0.05），enhance the delayed type hypersensitivity of mice（P＜0.05）and increase the level of antibody producing cell（P＜ 0.05）；the medium and low dosage of Quanxie health-care wine group could significantly strengthen NK cell activity.However，Quanxie health-care wine had no significant effects on ratio of spleen weight to body weight，ratio of thymus weight to body weight，serum hemolysin level，carbon clearance ability and macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes capacity（P＞0.05）.Quanxie health-care wine can enhance immunity function in mice.

Key words：Quanxie health-care wine；immunity function；mice

全蝎保健酒由全蝎、人參、制何首烏等藥材提取液加酒基調(diào)制而成。蝎子強(qiáng)身治病民間有數(shù)千年的歷史，《本草綱目》記載蝎子入藥可治如下疾病：“諸風(fēng)癔疹，及中風(fēng)半身不遂，口眼歪斜，語澀，手足抽掣。小兒驚惶風(fēng)搐，大人疴瘧，耳聾疝氣，諸風(fēng)瘡，女人帶下陰脫”等。近幾年對(duì)全蝎用于炎癥[1]、腫瘤的研究也有大量報(bào)道[2-3]。中國(guó)藥典記載：人參大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺；制何首烏補(bǔ)肝腎，益精血。本文依照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中有關(guān)增強(qiáng)免疫力功能的檢測(cè)方法，研究全蝎酒的增強(qiáng)免疫力的作用，為其作為保健品應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

全蝎保健酒，批號(hào)：201408300101，規(guī)格：125 mL/瓶，性狀：金黃色液體，由某酒業(yè)有限公司提供。保存條件：密閉，常溫干燥處，保質(zhì)期：24個(gè)月。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí) ICR 小鼠，200只，雄性，體重 18 g～22 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)：SCXK（魯）20140007。飼養(yǎng)環(huán)境：屏障級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SYXK（魯）2013 0012。溫度：20℃～25℃，日溫差≤3℃，濕度：40%～70%，換氣次數(shù)：≥10次/h。照明時(shí)間：12 h明暗交替。

1.3 儀器與試劑

BSA4202S電子天平：德國(guó)Sartorius公司；二氧化碳培養(yǎng)箱：德國(guó)memmert公司；紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；酶標(biāo)儀：美國(guó)MD公司；3k30離心機(jī)：德國(guó)希格瑪公司；顯微鏡：奧林巴斯公司；恒溫水浴鍋：上海樹立儀器儀表有限公司。

RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、HBSS液、Triton試劑、0.2 moL/L tris-HCl緩沖液等：自索萊寶公司；刀豆蛋白 A（Concanavalin A，縮寫 ConA）、MTT：Sigma-Aldrich公司；YAC-1細(xì)胞：山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、補(bǔ)體（豚鼠血清）、雞紅細(xì)胞臨用制備。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及受試物給予方式

小鼠按體重隨機(jī)分為4個(gè)免疫大組，每免疫大組小鼠50只，分為溶媒對(duì)照組、受試物低、中、高劑量組及空白對(duì)照組5個(gè)小組，每小組10只。免疫一組用于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）實(shí)驗(yàn)、血清溶血素的測(cè)定、抗體生成細(xì)胞數(shù)的測(cè)定；免疫二組用于小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)及臟器體重比值的測(cè)定；免疫三組用于小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定；免疫四組用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。設(shè)全蝎酒低、中、高劑量分別為0.85、1.7、5.1 g/kg·bw（按合生藥材計(jì)），相當(dāng)于人體推薦量的5、10、30倍劑量。臨用前用提供單位提供的曲酒將受試物配制成含15%的酒精的相應(yīng)受試物溶液。各組小鼠灌胃體積為20 mL/kg，溶媒對(duì)照組給予同等體積的15%的酒精，空白對(duì)照組給予同等體積的純化水，每天灌胃1次，連續(xù)30 d。

1.4.2 淋巴器官臟器/體重比值測(cè)定

每周稱量所有動(dòng)物體重，結(jié)束時(shí)處死小鼠。取出免疫二組小鼠的胸腺和脾臟，稱重并計(jì)算臟/體比值。臟/體/%=臟器重量/動(dòng)物體重×100。

1.4.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及NK細(xì)胞活性測(cè)定

末次給予受試樣品后，處死小鼠，無菌操作下取脾，研磨制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液后分成兩份（1號(hào)和2號(hào)），過200目篩網(wǎng)后HBSS液洗2次，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106個(gè)/mL（1號(hào)懸液）和2×107個(gè)/mL（2號(hào)懸液）。1號(hào)懸液用MTT法檢測(cè)經(jīng)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞的增殖能力；以2號(hào)懸液為效應(yīng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的YAC-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞終濃度至4×105個(gè)/mL作為靶細(xì)胞，依照LDH測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)定光密度值，計(jì)算NK細(xì)胞活性。

1.4.4 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）、血清溶血素測(cè)定及抗體生成細(xì)胞檢測(cè)

小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（體積比）SRBC致敏后4 d，測(cè)量左后足跖厚度，然后在測(cè)量部位皮下注射20%（體積比）SRBC，每只小鼠注射 20 μL，注射后于24 h測(cè)量左后足跖部厚度，同一部位測(cè)量3次，取平均值。以攻擊前后足跖厚度的差值表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的程度。將小鼠摘除眼球取血，半數(shù)溶血值HC50測(cè)定法進(jìn)行血清溶血素的測(cè)定。隨后處死小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。按Jerne改良玻片法進(jìn)行抗體生成細(xì)胞檢測(cè)，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)，以空斑數(shù)/全脾細(xì)胞表示。

1.4.5 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

末次給予受試物后，稱體重，從小鼠尾靜脈10 mL/kg注入稀釋4倍的印度墨汁，注入后2、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。以0.1%Na2CO3溶液作空白對(duì)照，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)。

1.4.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

每只小鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，注射后30 min，頸椎脫臼處死小鼠，按半體內(nèi)法檢測(cè)，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Dunnett’s t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 全蝎酒對(duì)對(duì)小鼠淋巴器官臟器/體重比值的影響全蝎酒各劑量組小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重

比值與陰性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 全蝎保健酒對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響（s）Table 1 The effects of Quanxie health-care wine on ratio of spleen weight and thymus weight to body weight of mice

表1 全蝎保健酒對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響（s）Table 1 The effects of Quanxie health-care wine on ratio of spleen weight and thymus weight to body weight of mice

胸腺/體重比值/（mg/g）溶媒對(duì)照組 0 10 2.96±0.53 1.65±0.48低劑量組 0.85 10 3.00±0.66 1.56±0.45中劑量組 1.7 10 2.93±0.55 1.94±0.50高劑量組 5.1 10 2.74±0.38 1.84±0.46空白對(duì)照組 0 10 2.95±0.38 1.46±0.55組別 劑量/（g/kg·bw）動(dòng)物只數(shù)脾臟/體重比值/（mg/g）

2.2 全蝎保健酒對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

全蝎保健酒高劑量組可增強(qiáng)小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力，增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力，與溶媒對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（s）Table 2 The effects of Quanxie health-care wine on the ConA-induced lymphocyte transformation ability and the delayed type hypersensitivity of mice

表2 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（s）Table 2 The effects of Quanxie health-care wine on the ConA-induced lymphocyte transformation ability and the delayed type hypersensitivity of mice

注：*P＜0.05（與溶媒對(duì)照組比較，Dunnett’s t檢驗(yàn)）。

足跖腫脹度/mm溶媒對(duì)照組 0 10 0.29±0.90 0.28±0.08低劑量組 0.85 10 0.30±0.06 0.28±0.07中劑量組 1.7 10 0.34±0.11 0.32±0.09高劑量組 5.1 10 0.40±0.11* 0.37±0.08*空白對(duì)照組 0 10 0.29±0.08 0.28±0.07組別 劑量/（g/kg·bw）動(dòng)物只數(shù)加ConA孔與不加ConA孔吸光度的差值

2.3 全蝎保健酒對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)、血清溶血素的影響

全蝎保健酒高劑量組能顯著提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)水平，與溶媒對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。全蝎保健酒各劑量組對(duì)小鼠血清溶血素水平無顯著影響，與溶媒對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)、血清溶血素檢測(cè)結(jié)果（s）Table 3 The effects of Quanxie health-care wine on the level of antibody producing cell and the serum hemolysin of mice

表3 小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)、血清溶血素檢測(cè)結(jié)果（s）Table 3 The effects of Quanxie health-care wine on the level of antibody producing cell and the serum hemolysin of mice

注：*P＜0.05（與溶媒對(duì)照組比較，Dunnett’s t檢驗(yàn)）。

半數(shù)溶血值（HC50）溶媒對(duì)照組 0 10 22.08±4.97 187.14±14.32低劑量組 0.85 10 23.78±6.78 191.78±15.23中劑量組 1.7 10 26.86±6.76 196.63±11.19高劑量組 5.1 10 28.96±5.39* 199.76±13.29空白對(duì)照組 0 10 22.46±5.50 193.28±10.43組別 劑量/（g/kg·bw）動(dòng)物只數(shù)溶血空斑數(shù)（×103/全脾）

2.4 全蝎保健酒對(duì)小鼠碳廓清能力、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

全蝎保健酒各劑量組對(duì)小鼠碳廓清能力、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力均無影響，與溶媒對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（s）Table 4 The effects of Quanxie health-care wine on the carbon clearance ability and macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes capacity of mice

表4 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（s）Table 4 The effects of Quanxie health-care wine on the carbon clearance ability and macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes capacity of mice

腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)吞噬百分率 吞噬指數(shù)溶媒對(duì)照組 0 10 4.17±0.83 0.42±0.10 0.22±0.11低劑量組 0.85 10 4.97±0.73 0.45±0.08 0.26±0.09中劑量組 1.7 10 4.38±0.98 0.47±0.15 0.27±0.14高劑量組 5.1 10 4.85±0.79 0.47±0.11 0.29±0.10空白對(duì)照組 0 10 4.24±0.93 0.41±0.09 0.21±0.09組別 劑量/（g/kg·bw）動(dòng)物只數(shù)碳廓清實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)（a）

2.5 全蝎保健酒對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

全蝎保健酒中、高劑量組能增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性，與溶媒對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果（s）Table 5 The effects of Quanxie health-care wine on the NK cell activity of mice

表5 小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果（s）Table 5 The effects of Quanxie health-care wine on the NK cell activity of mice

注：*P＜0.05（與溶媒對(duì)照組比較，Dunnett’s t檢驗(yàn)）。

組別 動(dòng)物只數(shù) NK細(xì)胞活性百分率 NK細(xì)胞活性溶媒對(duì)照組 10 27.73±7.87 0.55±0.09低劑量組 10 33.86±11.13 0.62±0.12中劑量組 10 41.28±9.87* 0.70±0.10*高劑量組 10 41.03±11.70* 0.69±0.12*空白對(duì)照組 10 25.26±8.54 0.52±0.10

3 討論與結(jié)論

本研究從細(xì)胞免疫、體液免疫、吞噬功能、NK細(xì)胞功能4個(gè)方面考察全蝎保健酒對(duì)小鼠免疫功能的影響，并觀察其對(duì)動(dòng)物免疫器官的作用，結(jié)果顯示：ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，全蝎保健酒高劑量組可增強(qiáng)小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力，與溶媒對(duì)照組比較有顯著性差異；遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，全蝎保健酒高劑量組能增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力。提示全蝎保健酒能增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能。NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，全蝎保健酒高、中劑量組NK細(xì)胞活性與溶媒對(duì)照組比較差異有顯著性意義，提示全蝎保健酒具有增強(qiáng)NK細(xì)胞活性作用。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年版判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為全蝎保健酒具有增強(qiáng)免疫力功能的作用。

[1]劉芬,侯睿,費(fèi)巧玲,等.全蝎水提物對(duì)巨噬細(xì)胞活化作用研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2016,32(5):660-661

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[3]劉端勇,趙海梅,黃小英,等.全蝎蜈蚣對(duì)CIA大鼠外周血CD4～+CD25～+FoxP3～+Treg 細(xì)胞的調(diào)節(jié)[J].中藥材,35(4):525-526

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[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015年版一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:8-9,176-177

Experimental Study on Quanxie Health-care Wine in Enhancing Immunity Function

FAN Zhi-yun，QU Jian-song，LI Zhi-kun，ZHAO Yan-xia，ZHU Qing-fen
（Shandong Institute of Food and Drug Control，Jinan 250101，Shandong，China）

2017-02-03

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.039

范治云（1970—），男（漢），副主任藥師，碩士，研究方向：食品藥品保健品藥理毒理評(píng)價(jià)。