牛黃解毒片微生物限度檢查方法的探討

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新疆巴州藥品檢驗所，新疆 庫爾勒 841000

牛黃解毒片為《中華人民共和國藥典》2005年版一部品種，功能為清熱解毒。臨床上主要用于火熱內盛，咽喉腫痛，牙齒腫痛，口舌生瘡，目赤腫痛。處方中含有人工牛黃、石膏、黃芩、雄黃、大黃、桔梗、甘草、冰片等8位中藥組成。而其中人工牛黃、黃芩、大黃這3味中藥均具有較強的抑菌性，故必須采用適當的方法消除其抑菌性才能進行微生物限度檢查。通過研究，本文對細菌計數、霉菌和酵母菌數的測定以及控制菌—大腸埃希菌、大腸菌群的檢查。《中國藥典》2005年版規定建立微生物限度檢查法時，應進行細菌、霉菌和酵母菌計數方法及控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該制劑的細菌、霉菌和酵母菌數及控制菌的測定。本試驗按照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法有關規定，建立牛黃解毒片的微生物限度檢查法并加以驗證［1］，即采用大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗確定細菌數檢查法，采用白色念珠菌、黑曲霉菌試驗確定霉菌和酵母菌數的檢查法。按《中國藥典》規定，在采用常規法、培養基稀釋法等方法處理樣品后，加入以上五種菌，培養后回收率達70%以上，證明該法有效消除了藥品對細菌的抑制作用，可用該法進行藥品微生物限度檢查。本試驗所用樣品均由庫爾勒龍之源藥業有限責任公司提供，先取一個批號的樣品，選用敏感菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌進行預試驗，摸索出合適方法后再三個批號的樣品進行平行試驗。

1 儀器與材料

1.1 儀器 凈化工作臺型號SW－CJ－IB蘇州凈化設備廠;菌落計數器型號JLQ－SI江蘇省無錫縣電化教具廠;干燥箱 (電熱鼓風)型號101－1上海實驗儀器廠;高壓蒸汽消毒器 (手提式)YXQ.GO1.280型上海醫療核子儀器廠;生化培養箱型號LRH－150B廣州省醫療器械廠;培養箱(電熱恒溫)型號28YX－1銀川市金屬制品廠;天平 (電子)型號PL202－S/00上海梅特勒一托利多集團;生物安全柜型號BSC_1300_11_A/B3蘇州市華于凈化有限公司;勻漿儀 (電動)型號YJ－A浙江省臺州市椒江五星機械儀器有限公司。

1.2 標準菌種

大腸埃希菌 (Escherichia coli)(CMCC(B)44102)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) (CMCC(B)26003)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) (CMCC(B)63501)、白色念珠菌 (Candida albicans) (CMCC(F)98001)、黑曲霉 (Aspergillus niger)(CMCC(F)98003)本試驗所用菌種均為第三代，以上菌種均由新疆維吾爾自治區藥品檢驗所提供。

1.3 培養基、稀釋劑及試液 營養肉湯培養基 (批號:071116)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基 (批號:080616)、營養瓊脂培養基 (批號:080708)、麥康凱瓊脂培養基 (BacC)(批號:071224)、改良馬丁培養基 (批號:081127)、膽鹽乳糖培養基 (BL)(批號:0806042)、膽鹽乳糖發酵培養基 (批號:080218)、4－甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養基(MUG)(批號:070604)，(以上培養基生產單位為中國藥品生物制品檢定所，由北京牛牛基因技術有限公司提供);0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液 (批號:080925)，以上稀釋劑自配;靛基質試液。

1.4 供試品 牛黃解毒片 (庫爾勒龍之源藥業有限責任公司)。

2 方法與結果

2.1 細菌、霉菌及酵母菌計數的驗證［1］

2.1.1 菌液制備 ①取經37℃培養18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌營養肉湯培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為50～100cfu/mL菌懸液，備用。②取經25℃培養24～48h的白色念珠菌改良馬丁培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為50～100cfu/mL菌懸液，備用。③取經25℃培養1周的黑曲霉的斜面培養物，加5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為50～100cfu/mL菌懸液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100mL制備成1:10供試液。

2.1.3 方法驗證預試驗 選用金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌三種敏感菌株進行預試驗，摸索出合適方法。

常規法 取1∶10供試液1mL，分別加入敏感菌株金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌各50～100cfu，立即注入相應培養基15～20 mL，待培養基凝固后，置規定的溫度下倒置培養。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌培養24h，白色念珠菌培養48h。培養基稀釋法 取1∶10供試液0.5，0.2mL，分別注入平皿，加入敏感菌株金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌50～100cfu，注入營養瓊脂培養基15～20 mL，待培養基凝固后，置規定的溫度下倒置培養24h。

2.1.4 方法驗證預試驗結果 以上預試驗的回收率結果見表1。

表1 敏感菌株對幾種預試驗方法的回收率結果比較

根據上述預試驗結果，采用常規法及培養基稀釋法(供試液:0.5mL/皿)試驗時，枯草芽孢桿菌回收率均小于70%，表明牛黃解毒片對細菌抑制作用明顯;采用培養基稀釋法 (供試液:0.2mL/皿)試驗時，枯草芽孢桿菌回收率均大于70%，表明該法有效消除了牛黃解毒片對細菌抑制作用;采用常規法試驗時，白色念珠菌回收率為100%，說明牛黃解毒片對霉菌和酵母菌沒有抑制作用。初步確定牛黃解毒片細菌計數方法為培養基稀釋法 (供試液:0.2mL/皿)，霉菌和酵母菌計數方法為常規法。

2.1.5 細菌數、霉菌和酵母菌數測定方法的驗證［1］取3個批號的牛黃解毒片樣品，細菌按培養基稀釋法 (供試液:0.2mL/皿)進行細菌回收率試驗，霉菌和酵母菌按常規法進行加菌回收率試驗，結果見表2。

表2 培養基稀釋法 (0.2mL/皿)5種陽性菌回收率試驗結果

上述試驗說明，采用培養基稀釋法 (供試液:0.2mL/皿)試驗時，三個批號的藥品中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率均大于70%，該法可用于藥品細菌數檢查;采用常規法試驗時，三個批號的藥品中白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均大于70%，該法可用于藥品的霉菌和酵母菌數檢查。

2.2 控制菌檢查方法驗證［1］

2.2.1 大腸埃希菌檢查方法驗證 ①試驗組:取1∶10供試液10mL接種至100mL膽鹽乳糖培養基 (BL)中，同時加入大腸埃希菌 10～100cfu，35℃培養 24h。取培養物0.2mL接種至5mL MUG培養基試管中，35℃培養于5，24h，在365nm紫外燈光下觀察熒光，然后再進行靛基質試驗。另取培養物在麥康凱瓊脂培養基平板上劃線，35℃培養24h，觀察其菌落形態。②陰性菌對照組:取1:10供試液10mL接種至100mL膽鹽乳糖培養基 (BL)中，同時加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，作為陰性菌對照試驗菌，方法同試驗組。結果見表3。

表3 大腸埃希菌試驗結果

2.2.2 大腸菌群檢查方法驗證

①試驗組:取1:10供試液1mL接種至10mL膽鹽乳糖發酵管培養基中，同時加入大腸埃希菌10～100cfu，35℃培養18～24h。另取培養物在麥康凱瓊脂培養基平板上劃線，35℃培養18～24h，觀察其菌落形態。②陰性菌對照組:取1:10供試液1mL接種至10mL膽鹽乳糖發酵管培養基中，同時加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，作為陰性菌對照試驗菌，方法同試驗組。結果見表4。

3 討論

具有抑菌性藥物的微生物限度檢查結果的準確性，主要取決于樣品本身在試驗條件下是否抑制被檢微生物的生長繁殖。檢驗時應排除其抑制作用，使之不干擾染菌限度檢驗，結果方屬有效。本試驗通過預試驗，采用排除法確認可行的方法。3批樣品的驗證試驗結果表明:①采用培養基稀釋法對牛黃解毒片進行細菌數的測定，3種規定試驗菌的回收率均大于70%，可把外界影響、制劑工藝因素(如原材料處理)和操作者的主觀因素減少到最低，更客觀、公正、科學，符合《中國藥典》2005年版一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法的規定，方法可行。②采用常規法進行霉菌及酵母菌數的測定，兩種規定試驗菌的回收率均大于70%，方法可行;③采用常規法檢查牛黃解毒片中的大腸埃希菌和大腸菌群，方法可行。

［1］國家藥典委員會.中國藥典 (一部) ［S］.北京:化學工業出版社，2005:附錄70－79.