上海市犬類巴爾通體感染情況調(diào)查

陳琦 杜玉明 楊德全 楊君 袁聰俐 俞向前 周錦萍*

（1，上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 201103;2，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 200240;3，上海市浦東新區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 201200）

上海市犬類巴爾通體感染情況調(diào)查

陳琦1杜玉明2楊德全1楊君2袁聰俐2俞向前3周錦萍1*

（1，上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 201103;2，上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 200240;3，上海市浦東新區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 201200）

為了解上海市犬類巴爾通體感染情況，根據(jù)已發(fā)表的巴爾通體保守基因序列合成1對(duì)PCR引物，對(duì)上海市6個(gè)區(qū)縣采集149份犬全血樣品進(jìn)行檢測(cè)。25份樣品擴(kuò)增出特異性條帶，陽(yáng)性率為16.78%，對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)為B.vinsoniiberkhoffii菌株。結(jié)果表明，上海市犬的中存在不同程度的巴爾通體感染情況。

犬;巴爾通體;感染;檢測(cè);上海市

巴爾通體（Bartonella）是由秘魯科學(xué)家Alberto Barton在1909年從Oroya熱病人的紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種微生物,并于1913年正式命名為巴爾通體。巴爾通體屬于細(xì)菌域（Bacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、 α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、根瘤菌目（Rhizobiales）、巴爾通體科（Bartonellaceae）、巴爾通體屬（Bartonella）。巴爾通體的宿主范圍比較廣泛,目前已發(fā)現(xiàn)確認(rèn)的宿主或潛在宿主的有貓、犬、兔、牛和鼠以及野生動(dòng)物如蝙蝠、美洲獅和狐貍等[1]。昆蟲(chóng)是大部分巴爾通體菌的傳播媒介,如白蛉、虱、跳騷、蜱和螨蟲(chóng)等。目前已發(fā)現(xiàn)至少發(fā)現(xiàn)30個(gè)種及亞種,其中至少有9種對(duì)人有致病性。人類可能通過(guò)與攜帶巴爾通體的犬、貓接觸或被跳蚤、虱子叮咬而感染[2]。隨著城市犬、貓的增多,接觸日益密切,了解城市犬中的巴爾通體感染狀況具有一定的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1.1 陽(yáng)性對(duì)照菌株

巴爾通體標(biāo)準(zhǔn)菌株Bartonella henselae作為對(duì)照（來(lái)源于上海交通大學(xué)）。

1.2 樣品采集與保存

2016年2月到2016年6月,在上海市6個(gè)區(qū)縣,包括寶山區(qū)、虹口區(qū)、楊浦區(qū)、普陀區(qū)、浦東新區(qū)和崇明縣,采集家養(yǎng)寵物犬和農(nóng)村犬全血裝于抗凝管中,共采集犬血液樣本149份,置-70℃超低溫冰柜保存。

1.3 樣品核酸的提取

采用OMEGA公司的BloodDNA kit抽提血液樣本中的DNA,具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 檢測(cè)引物及反應(yīng)條件

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn),找到巴爾通體基因組的保守基因RpoB,根據(jù)基因序列,利用Premier6.0設(shè)計(jì)一對(duì)引物RpoB Forwards和RpoB Rewards。 參見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)引物

根據(jù)2×HieffTMPfu Master Mix的說(shuō)明書(shū)配制25μl反應(yīng)體系, 反應(yīng)條件是：95℃,2min； 95℃,10s； 60℃,20s；72℃,30s； 34cycles； 72℃,7min； 12℃保存。

1.5 遺傳進(jìn)化分析

對(duì)PCR陽(yáng)性樣本進(jìn)行記錄之后,再進(jìn)行大體系擴(kuò)增RpoB片段,對(duì)片段切膠回收之后,按照TA克隆的說(shuō)明書(shū)構(gòu)建TA克隆,鑒定出克隆陽(yáng)性樣品送測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析,確定巴爾通體種屬,利用軟件MEGA7.0進(jìn)行了進(jìn)化關(guān)系的分析,構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴爾通體檢測(cè)結(jié)果

PCR檢測(cè)犬的血液樣本149份,其中感染巴爾通體的陽(yáng)性樣本25份,總陽(yáng)性率為16.78%。各區(qū)縣的犬均有不同程度的感染情況,感染陽(yáng)性率從6.67～23.53%。具體情況見(jiàn)表2。部分樣品電泳圖見(jiàn)圖1。

2.2 遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

在犬的血液樣本檢測(cè)過(guò)程中,我們將2份陽(yáng)性PCR樣品構(gòu)建TA克隆之后送去上海鉑尚生物公司測(cè)序。我們對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,利用Clusta W進(jìn)行序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)一株新的菌株,命名為Bartonella SH.CN strain1。利用Blast在線軟件和MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖2）。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)的這株巴爾通體菌與B.vinsoniiberkhoffii的同源性較高,所以Bartonella SH.CN strain1是B.vinsoniiberkhoffii菌株,是上海地區(qū)犬感染的主要的巴爾通體。

表2 巴爾通體感染狀況檢測(cè)結(jié)果

圖1 部分樣品的PCR電泳圖

圖2 進(jìn)化樹(shù)圖譜

3 討論

巴爾通體是一種人畜共患病病原大多數(shù)哺乳動(dòng)物如犬科、貓科、嚙齒類、反芻類等動(dòng)物,包括人類都是不同亞種巴爾通體的宿主。巴爾通氏體感染后可以引起菌血癥、淋巴結(jié)炎癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、關(guān)節(jié)炎等癥狀[3]。對(duì)人類有致病性的巴爾通體主要有漢賽巴爾通體（B.henselae）、伊麗莎白巴爾通體（B.elizabethae）、克氏巴爾通體（B.clarridgeiae）、五日熱巴爾通體（B.quintana)）等9種,可引起人類戰(zhàn)壕熱、貓抓病 (cat scratch diease,CSD)、卡瑞恩病、心內(nèi)膜炎、菌血癥和桿菌樣血管瘤等疾病[4-5]。

犬類是巴爾通體的自然宿主,已被確認(rèn)能夠感染包括Bartonella vinsonii berkhoffii,Bartonella henselae,Bartonella clarridgeiae等在內(nèi)的多種巴爾通體亞型。中國(guó)山東從犬中分離到B.vinsonii berkhoffi；美國(guó)在犬中檢出2.2～8.7%抗體陽(yáng)性,巴西在犬中檢出1.0～5.9%抗體陽(yáng)性；研究表明,狗抗體陽(yáng)性率與虱子感染嚴(yán)重程度有關(guān)[6-7]。巴爾通體感染犬導(dǎo)致的疾病主要有心內(nèi)膜炎、心律失常、心肌炎、肉芽腫性淋巴結(jié)炎等[8-9]。文章調(diào)查顯示在心內(nèi)膜炎患者的瓣膜中擴(kuò)增出文森巴爾通體,證實(shí)文森巴爾通體對(duì)于人類是有致病性的,也證實(shí)犬科動(dòng)物是文森巴爾通體特異性宿主[9-10]。

本文中各區(qū)縣犬感染巴爾通體的陽(yáng)性率為6.67～23.53%不等,而從樣品來(lái)源上看,普陀區(qū)等3個(gè)中心城區(qū)的犬只均為家庭飼養(yǎng)的寵物犬,飼養(yǎng)管理?xiàng)l件較好,而其他3個(gè)區(qū)縣的犬只均為散養(yǎng)農(nóng)村犬,飼養(yǎng)管理?xiàng)l件較差,帶有跳蚤等體外寄生蟲(chóng)的可能性較大,故陽(yáng)性率明顯高于另3個(gè)區(qū)。這提醒我們應(yīng)加強(qiáng)犬只衛(wèi)生條件及體表寄生蟲(chóng)的去除,從而減少巴爾通體的感染情況。

隨著上海等大城市中寵物犬只的數(shù)量日益增多,寵物與人類的接觸也日漸頻繁,同時(shí)流浪犬貓的數(shù)量也在急劇增長(zhǎng),與犬貓相關(guān)人畜共患病發(fā)生的概率也越來(lái)越高,相關(guān)疫病也越來(lái)越引起人們注意,其城市公共衛(wèi)生安全的意義得以日益凸顯。

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上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃 〔滬農(nóng)青字（2015）第2-5號(hào)〕。

陳琦（1979-），男，漢族，湖南省攸縣人，碩士，獸醫(yī)師，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。

*為通訊作者。