巴西橡膠樹逆境響應(yīng)基因HbPRX53的克隆與表達(dá)分析

王紀(jì)坤，王立豐，安 鋒，謝貴水

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，海南 儋州 571737）

巴西橡膠樹逆境響應(yīng)基因HbPRX53的克隆與表達(dá)分析

王紀(jì)坤，王立豐，安 鋒，謝貴水

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，海南 儋州 571737）

在干旱脅迫下，橡膠樹過氧化物酶活性顯著增加。為了研究干旱響應(yīng)的過氧化物酶基因功能，從橡膠樹中克隆了HbPRX53全長DNA。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，HbPRX53含有334個(gè)氨基酸和1個(gè)植物過氧化物酶結(jié)構(gòu)域。聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與擬南芥過氧化物酶AtPRX53最相近。HbPRX53在橡膠樹樹皮、葉片、膠乳和花中均有表達(dá)，但在葉片中表達(dá)量最高，白粉菌侵染、機(jī)械傷害和干旱顯著上調(diào)葉片中HbPRX53的表達(dá)。此外，吲哚乙酸、脫落酸、水楊酸乙烯、過氧化氫和茉莉酸處理也會(huì)上調(diào)HbPRX53表達(dá)。這說明HbPRX53與橡膠樹對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)密切相關(guān)。

干旱；HbPRX53；橡膠樹；激素

Abstract：Peroxidase activity significantly increased under drought stress in rubber tree. To identify the functions of peroxidase genes responsive to drought stress，the full-length cDNA of HbPRX53 was isolated from rubber tree. Bioinformatics analysis showed that HbPRX53 contained 334 amino acid residues and a plant peroxidase-like superfamily domain. Phylogenetic analysis with Arabidopsis Class III peroxidases revealed that HbPRX53 shared high identities with AtPRX53. Although HbPRX53 was expressed in bark，leaf，latex and flower，it was preferentially expressed in leaf in rubber tree. HbPRX53 expression was significantly upregulated in leaves by powdery mildew infection，mechanical wounding and drought stress. Moreover，indole acetic acid，abscisic acid，salicylic acid ethylene，H2O2and methyl jasmonate treatments also led to marked accumulation of HbPRX53 transcripts in leaves. These results indicated HbPRX53 is a key factor in both biotic and abiotic stress responses in rubber tree.

Key words：drought；HbPRX53；rubber tree；hormone

過氧化物酶（EC1.11.1.7）是一類以血紅素為輔基的酶，在生物中廣泛存在，具有多種不同的生物功能，主要催化過氧化氫對(duì)多種有機(jī)物和無機(jī)物的氧化作用［1-2］。過氧化物酶家族可分為3個(gè)亞家族：第1族為胞內(nèi)過氧化物酶，包括細(xì)菌過氧化物酶、抗壞血酸、過氧化氫和細(xì)胞色素C氧化酶等；第2族為真菌分泌的過氧化物酶，如木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶；第3族為植物過氧化物酶，通過信號(hào)肽定位在分泌路徑［3］。植物過氧化物酶在眾多組織中表達(dá)，并在植物代謝和生理過程中起作用，如氧化脅迫響應(yīng)、種子外衣黏液分泌、木質(zhì)化、栓化作用、生長素代謝、乙烯合成、細(xì)胞壁交聯(lián)、防御真菌侵染和鹽脅迫等［4-5］。迄今為止，擬南芥中發(fā)現(xiàn)73個(gè)過氧化物酶家族成員［6］，并鑒定了部分基因功能［3］。AtPER53，也叫PRXR1（At4G21960.1），參與病蟲害脅迫［7］、干旱響應(yīng)［8］、ABA 調(diào)控種子萌發(fā)等生理過程［9］。

中國是橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）非傳統(tǒng)植膠區(qū)。中國橡膠樹種植經(jīng)常受寒害、干旱和風(fēng)害的威脅［10-11］。植物對(duì)逆境的響應(yīng)與激素信號(hào)等信號(hào)間交互有關(guān)，如脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）等。盡管報(bào)道了多種逆境條件誘導(dǎo)過氧化物酶活性，但對(duì)橡膠樹中的過氧化物酶的功能尚不清楚，例如，用生化方法僅在橡膠樹樹皮和細(xì)胞懸浮液中分離出1個(gè)過氧化物酶［12］；橡膠樹中過表達(dá)活性氧相關(guān)基因HbCuZnSOD導(dǎo)致橡膠樹抗干旱能力增強(qiáng)和過氧化物酶活性增高［13］；我們最近還發(fā)現(xiàn)干旱會(huì)導(dǎo)致過氧化氫含量和過氧化物酶活性上升［14］。據(jù)此，我們推測(cè)過氧化物酶在橡膠樹逆境抗性中具有重要作用。本研究從橡膠樹葉片中克隆過氧化物酶HbPRX53基因，并分析其在不同逆境和激素處理?xiàng)l件下的表達(dá)規(guī)律，為研究過氧化物酶在橡膠樹逆境響應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)場(chǎng)二隊(duì)15年生巴西橡膠樹品種熱研7-33-97成齡開割樹為材料，進(jìn)行組織表達(dá)分析。以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)場(chǎng)五隊(duì)培育的熱研7-33-97一年生芽接苗為材料，選取均勻一致的4蓬葉且頂篷葉片處于穩(wěn)定期的芽接苗進(jìn)行白粉菌侵染、機(jī)械傷害、干旱和激素處理［14-15］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理方法 采集巴西橡膠樹品種熱研7-33-97成齡開割樹頂棚穩(wěn)定期葉片、4月盛開的花、正常3 d一刀割取的膠乳和樹皮，用于組織表達(dá)分析。以熱研7-33-97一年生芽接苗為材料，白粉菌侵染采用在變色期葉片人工接種橡膠樹白粉菌的方法，根據(jù)葉片感病程度分級(jí)，收集0、1、3、5、7級(jí)葉片。機(jī)械傷害采用寬頭鑷子夾傷橡膠樹葉片表皮的方法，收集0.5、1、2、6、10、24 h的葉片，以未處理的植株作為對(duì)照。干旱處理采用澆飽和水后斷水的方法，連續(xù)采集0～10 d的葉片。激素和過氧化氫處理分別采用100 μmol/L吲哚乙酸（IAA）、200 μmol/L脫落酸（ABA）、5 mmol/L水楊酸（SA）、1.0% （V/V）乙烯利（釋放乙烯，ET）、2%（V/V）過氧化氫（H2O2）和200 mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）噴施橡膠樹葉片，分別在0、0.5、2、6、10、24、48、72 h采集葉片樣品，所有藥劑用0.05% （V/V）乙醇進(jìn)行溶解，對(duì)照植株噴施0.05% （V/V）乙醇水溶液。

1.2.2 總RNA提取 從上述處理收集的樹皮、葉片、膠乳和花中提取總RNA［15］，使用RNasefree DNase （Promega）去除基因組DNA，提取的RNA質(zhì)量和濃度使用瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸蛋白分析儀（Thermo Fisher Nanodrop 2000，USA）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 HbPRX53全長cDNA的克隆 根據(jù)GenBank上公布人類、擬南芥和蓖麻等過氧化物酶蛋白序列，在橡膠樹EST數(shù)據(jù)庫中做tBlastn搜索，通過DNAman軟件拼接同源片段，得到巴西橡膠樹HbPRX53基因的cDNA序列［16］。采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)基因特異引物HbPRX53-F1（5′-ATGGGTGCCAAAGCTCTTTTCTTC-3′）和HbPRX53-R1 （5′-CTAGAAAAGTAACGAT GTTTCTG-3′），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第1鏈為模板，擴(kuò)增巴西橡膠樹過氧化物酶基因的cDNA序列。使用2×Taq PCR MasterMix（天根生化，北京）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，上游引物（10 μ/mol L）1 μL，下游引物（10 μmol/ L）1 μL，2×PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性 3 min，94℃變性30 s，55℃退火 50 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，凝膠回收純化，并克隆到pMD19-T載體上，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 蛋白結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)分析 采用NCBI ORF Finder在線分析預(yù)測(cè)過氧化物酶基因編碼的氨基酸序列及其ORF，通過Expasy的ProtParam在線分析巴西橡膠樹過氧化物酶蛋白中各種氨基酸含量，并預(yù)測(cè)理論分子量和等電點(diǎn)［19］；用 NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫和SMART在線分析軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)［20］；用SignalP 4.1 Server在線分析信號(hào)肽結(jié)構(gòu)；用TMHMM 2.0 Server在線分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域［21］。在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中通過blastp搜索其他物種的過氧化物酶同源蛋白并獲取其序列，利用MEGA7.01軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中bootstrap設(shè)為1 000［22］。

1.2.5 cDNA合成和熒光定量PCR 利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas）進(jìn)行cDNA合成。熒光定量引物為（HbPRX53-F2：5′-GAGAAGG AGACAGACAGAAG-3′ HbPRX53-R2：5′-T AGCAGACAGCACAAGGA-3′; PCR產(chǎn)物預(yù)期大小124 bp ），內(nèi)參基因?yàn)镠bActin （GenBank登錄號(hào)：HO004792），引物同文獻(xiàn)［21］。采用2-ΔΔCT法分析表達(dá)量，即用處理的表達(dá)量減去對(duì)照的表達(dá)量，以表達(dá)量差值作為不同處理下的表達(dá)結(jié)果［22-23］。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件（版本號(hào)23）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncan’s檢驗(yàn)分析不同處理間基因表達(dá)的差異顯著性。采用Origin2017科技繪圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西橡膠樹HbPRX53基因克隆與生物信息學(xué)分析

利用引物HbPRX53-F1、HbPRX53-R1和RT-PCR技術(shù)從橡膠樹基因組序列中克隆得到HbPRX53基因。HbPRX5基因（GenBank 登錄號(hào)：KM086712）全長1 179 bp，包括29 bp 5′-UTR（非編碼區(qū)）、148 bp 3′-UTR和1 002 bp ORF（開放讀碼框），編碼334個(gè)氨基酸（圖1）。HbPRX53蛋白的分子量為34.8 ku，等電點(diǎn)為5.08，是疏水性蛋白。生物信息學(xué)表明，HbPRX53是典型的過氧化物酶蛋白，在30～331位氨基酸處具有保守性過氧化物酶結(jié)構(gòu)域（圖2，封二）。該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，在29～30位氨基酸間存在1個(gè)信號(hào)肽。同源序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，HbPRX53蛋白與天藍(lán)遏藍(lán)菜NcPRX（JAU25708.1）、可可樹TcPRX2（EOY09519.1）、擬南芥AtPRX53（OAO93826.1）、大豆 GsPRX53（KHN41710.1）的相似性分別達(dá)到84%、83%、79%和77%。與所有擬南芥的過氧化物酶進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)HbPRX53與AtPRX53最為相近（圖3）。

圖 1 HbPRX53 cDNA區(qū)域的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列

圖 4 HbPRX53 在不同組織（樹皮、葉片、膠乳、花）和不同脅迫（白粉菌侵染、機(jī)械傷害和干旱處理）下的表達(dá)比較

2.2 HbPRX53的表達(dá)分析

2.2.1 HbPRX53在樹皮、葉、膠乳和花中的表達(dá)分析 組織分析表明，HbPRX53基因在樹皮、葉、膠乳和花中均有表達(dá)，其中葉片中基因的表達(dá)量最高，是膠乳中的1 150倍，樹皮和花中的表達(dá)量是膠乳中的100倍和37倍（圖4）。

2.2.2 白粉菌侵染、機(jī)械傷害和干旱處理葉片中HbPRX53的表達(dá)分析 從圖4可見，在白粉菌侵染后不同級(jí)別葉片中，HbPRX53基因的表達(dá)量在誘導(dǎo)初期顯著上升，隨后又恢復(fù)到處理前水平，但在5級(jí)病害時(shí)表達(dá)量又明顯上升。在機(jī)械傷害后6 h，HbPRX53基因的表達(dá)量先顯著上升再顯著下降，在10 h達(dá)到表達(dá)最高值，是處理后0.5 h的6倍。斷水處理后1 d，基因表達(dá)量明顯上升，第2天表達(dá)量又恢復(fù)處理前水平，在第3天基因表達(dá)量達(dá)到最高值，是處理前的7倍，隨后又顯著下降，但仍高于處理前水平。說明HbPRX53與橡膠樹對(duì)生物和非生物的脅迫響應(yīng)有關(guān)。

2.2.3 IAA、ABA、SA、ET、JA 和H2O2處理葉片中HbPRX53的表達(dá)分析 HbPRX53基因在各種激素和H2O2的誘導(dǎo)下表達(dá)模式如圖5所示。在IAA和H2O2處理后2 h內(nèi)基因表達(dá)量顯著下降，在6 h內(nèi)都顯著上升。隨后H2O2誘導(dǎo)基因表達(dá)量顯著下降，IAA在處理后48 h，再次誘導(dǎo)基因上調(diào)表達(dá)，達(dá)到表達(dá)量最高值，是處理前的4.5倍。在ABA、SA、ET和JA誘導(dǎo)下，HbPRX53基因在處理后2 h內(nèi)，表達(dá)量先顯著上升后顯著下降。在處理后6 h，基因表達(dá)量又顯著上升，其中ET和JA表達(dá)量達(dá)到最高值，分別是處理前的9倍和4.5倍，ABA在處理后10 h達(dá)到表達(dá)量最高值，SA則在處理后48 h達(dá)到最高值，是處理前的8.2倍。HbPRX53基因在5個(gè)植物激素和H2O2的分別誘導(dǎo)下，均是在2 h達(dá)到表達(dá)量的最低值。

圖 5 HbPRX53在5種激素和H2O2處理下的表達(dá)比較

3 討論

植物的過氧化物酶大多含有一個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域——分泌過氧化物酶結(jié)構(gòu)域。本文中HbPRX53蛋白的30～331位氨基酸為此特征結(jié)構(gòu)域。植物中廣泛存在的第3類過氧化物酶均帶有信號(hào)肽，主要通過分泌途徑起作用［26］。生物信息學(xué)分析表明，HbPRX53是疏水性蛋白，含有信號(hào)肽，蛋白序列與其他過氧化物酶成員高度保守，在系統(tǒng)進(jìn)化上與擬南芥AtPRX53最為接近，綜上分析說明，HbPRX53是過氧化物酶家族第3族成員。

橡膠樹的另一個(gè)過氧化物酶HbPRX42在花和膠乳中顯著高表達(dá)，是參與生殖過程和膠乳新陳代謝相關(guān)的過氧化物酶［27］。辣椒CavPrx 在花中高表達(dá)，參與花粉管延伸［28］。水稻的21個(gè)過氧化物酶基因，主要都在根中表達(dá)［29］。擬南芥大部分過氧化物酶基因在所有組織器官中均有高量表達(dá)［30］。HbPRX53與擬南芥過氧化物酶基因在組織表達(dá)上具有相似性，主要在葉片中起作用。本研究發(fā)現(xiàn)HbPRX53在葉片中顯著表達(dá)，在樹皮、膠乳和花中均有表達(dá)，但表達(dá)量顯著低于葉片中的表達(dá)量。說明不同過氧化物酶成員在植物不同組織中的表達(dá)具有差異性。

植物基因組眾多的過氧化物酶基因參與眾多生理過程和激素信號(hào)［31］，其蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間顯著相關(guān)［6］。這在擬南芥、水稻和大麥中均有深入研究［32］。前人研究表明，過氧化物酶基因?qū)；院軓?qiáng)，并多與活性氧清除有關(guān)［4］，參與抗逆脅迫和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［33］。本研究發(fā)現(xiàn)HbPRX53受干旱和機(jī)械傷害后，先顯著上調(diào)表達(dá)，后顯著下調(diào)表達(dá)，這與前人研究結(jié)果一致［8，14-15］。PRXs能夠通過催化細(xì)胞壁的交聯(lián)部位，創(chuàng)造一個(gè)物理屏障來限制寄主組織中真菌，響應(yīng)不同的刺激，如機(jī)械傷害和真菌侵染。本研究中，在白粉菌侵染作用下，橡膠樹葉片中HbPRX53的表達(dá)量先顯著上升，后顯著下降，與機(jī)械傷害作用下基因的表達(dá)模式相同。說明HbPRX53在生物和非生物脅迫下，基因的表達(dá)量均受到誘導(dǎo)，具有PRXs家族普遍存在的功能［34］。

研究表明，植物激素能夠誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因表達(dá)量增加，包括SA、JA和ET［33］。SA具有一定的抗真菌病害能力［36］，JA和ET的信號(hào)途徑會(huì)影響植物生長和防御響應(yīng)［37］。本研究中，在SA、ET和JA 3種激素分別作用下，HbPRX53的基因表達(dá)模式相同，且符合前人的研究結(jié)果，均是在處理初期顯著上升，在處理2 h表達(dá)量達(dá)到最低值，隨后又顯著上升。ET和JA都是在處理后6 h調(diào)控HbPRX53表達(dá)到最高值。由于H2O2是生物和非生物脅迫應(yīng)答下普遍會(huì)產(chǎn)生的一種化學(xué)成分［38］，推導(dǎo)其在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起到相互調(diào)節(jié)的作用，是交叉耐受性的一個(gè)信號(hào)分子［39］。ABA在植物面臨脅迫和諸多生理過程中也有著重要作用［40］。本研究中，HbPRX53 在H2O2刺激下，基因表達(dá)量先顯著下降再顯著上升后又顯著下降。與干旱和機(jī)械傷害作用下基因的表達(dá)模式正好相反，推測(cè)該基因在受到脅迫時(shí)初期顯著表達(dá)，隨后由于H2O2的大量產(chǎn)生，基因表達(dá)量變化模式受H2O2的影響。可見，HbPRX53在橡膠樹抗逆響應(yīng)中具有重要作用，有必要深入研究其結(jié)構(gòu)功能和調(diào)控機(jī)制。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Cloning and gene expressions of stress responsive gene HbPRX53 in rubber tree

WANG Ji-kun，WANG Li-feng，AN Feng，XIE Gui-shui
（Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Danzhou Investigation &Experiment Station of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737，China）

S794.1；Q786

A

1004-874X（2017）06-0063-08

王紀(jì)坤，王立豐，安鋒，等.巴西橡膠樹逆境響應(yīng)基因HbPRX53的克隆與表達(dá)分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（6）：63-70.

2017-04-26

海南省自然科學(xué)基金（20153151）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-34-ZP1）；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1630022015013）

王紀(jì)坤（1979-），男，碩士，助理研究員，E-mail：kunjiwang@163.com

謝貴水（1967-），男，博士，研究員，E-mail：xie23300459@163.com