解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)XZ-1發酵條件的優化

楊冬靜,趙永強,孫厚俊,張成玲,徐 振,謝逸萍

(江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所/中國農業科學院 農業部甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131)

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)XZ-1發酵條件的優化

楊冬靜,趙永強,孫厚俊,張成玲,徐 振,謝逸萍*

(江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所/中國農業科學院 農業部甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131)

采用單因素試驗和正交試驗,對解淀粉芽孢桿菌菌株XZ-1的發酵培養基成分和發酵條件進行了優化。結果表明：XZ-1的發酵培養基的最佳碳源、氮源和無機鹽分別為糊精、蛋白胨和氯化鉀；其培養基最佳組分為糊精10 g/L,蔗糖5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉7 g/L;最佳發酵培養條件為培養基初始pH值6,發酵溫度27 ℃,發酵時間36 h,裝液量100 mL/250 mL,接種量3%,轉速150 r/min。

解淀粉芽孢桿菌;單因素試驗;正交試驗;發酵條件;優化

Abstract： The fermentation medium components and fermentation conditions forBacillusamyloliquefaciensstrain XZ-1 were optimized through single-factor test and orthogonal test. The results illustrated that the optimal carbon source, nitrogen source and inorganic salt in fermentation medium for XZ-1 were dextrin, peptone and potassium chloride, respectively. The best medium components included dextrin 10 g/L, sucrose 5 g/L, peptone 10 g/L and sodium chloride 7 g/L. The optimized fermentation conditions were initial pH-value 6 for medium, fermentation temperature 27 ℃, fermentation time 36 h, liquid medium volume 100 mL/250 mL, inoculum size 3%, and rotate speed 150 r/min.

Keywords：Bacillusamyloliquefaciens; Single-factor test; Orthogonal test; Fermentation condition; Optimization

隨著我國經濟的高速發展、人們生活水平的不斷提高,人們的消費觀念已經逐漸轉變,對農業生產從單純追求高產,到今天已經在追求優質安全。由于化學藥劑防治帶來的環境污染、農藥殘留嚴重影響了人類的健康,因此生物防治以其無毒、無殘留、對環境友好等優勢吸引了國內外大量植保科研工作者的注意。其中,解淀粉芽孢桿菌是眾多生防菌種中的一種,是自然界中廣泛存在的一種細菌,它繁殖迅速,對人畜無毒無害,與環境友好,且可產生芽孢并由此具有較強的耐逆性[1]。已有的研究結果表明,解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌親緣關系很近,可產生脂肽類和蛋白類抗菌物質,具有廣譜抗細菌和抗真菌活性[2-3],已得到廣泛的生產和應用,如德國ABiTEP GmbH 公司已將解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensFZB42登記并產業化[4]。此外,解淀粉芽孢桿菌還能提高植物的抗鹽能力,如Chen等(2017)研究表明解淀粉芽孢桿菌菌株SQR9通過產生亞精胺可誘導擬南芥和玉米產生抗鹽性[5]。可見,解淀粉芽孢桿菌已成為農作物安全生產的重要資源之一。

本課題組從江蘇省徐州市銅山區班井村甘薯種植地分離篩選出解淀粉芽孢桿菌菌株XZ-1,該菌株具有廣譜抗真菌活性,對草莓炭疽病菌、絲瓜炭疽病菌、甘薯干腐病菌、小麥全蝕病菌、大豆菌核病菌、大蒜葉枯病菌、甜瓜枯萎病菌以及小麥紋枯病菌等病原真菌均有較強的拮抗活性(另文發表)。鑒于此，我們采用單因素試驗設計和正交試驗設計,進一步對解淀粉芽孢桿菌XZ-1開展了發酵培養基及發酵條件的優化研究,以期為該菌株的大規模生產應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1供試菌株

解淀粉芽孢桿菌XZ-1從江蘇省徐州市銅山區班井村甘薯根際土壤中分離,經本課題組篩選鑒定后保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2培養基

牛肉膏蛋白胨(NB)培養基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,葡萄糖2.5 g,蒸餾水1000 mL,用于XZ-1活化以及發酵液的制備;該培養基于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min,備用[6]。

1.3菌體生物量的測定

采用酶標儀(Thermo Multiskan GO, USA),取300 μL發酵液于酶標板中,以液體培養基為對照,測定OD600值；以OD600值作為判斷菌體生物量大小的標準,若OD600值越大則菌量越大[7]。

1.4培養基成分的優化

碳源:分別用5 g/L的蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、檸檬酸、木糖和糊精替代NB發酵培養基中的葡萄糖,制成培養基進行發酵培養。分別取50 μL種子發酵液，接種到各種含不同碳源的液體培養基中,在250 mL三角瓶中裝液體培養基的量為150 mL,在28 ℃、180 r/min轉速下培養24 h后取出,用酶標儀測定OD600值；每個處理3次重復,篩選出最佳碳源。

氮源:分別用10 g/L的蛋白胨、尿素、NH4Cl、酵母提取物、NH4NO3、(NH4)2SO4和酵母膏代替NB培養基中的蛋白胨和牛肉膏,其他接種、培養和測定方法同上；每個處理3次重復,篩選出最佳氮源。

無機鹽:分別在NB培養基中加5 g/L的氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、硫酸鋅、硫酸銅和硫酸鐵,其他接種、培養和測定方法同上；每個處理3次重復,篩選出最佳無機鹽。

多因素正交試驗:盡管以氯化鉀為無機鹽條件下發酵液的OD600值顯著高于以氯化鈉為無機鹽條件下的,但是市場上氯化鉀的價格約為氯化鈉價格的2倍,因此考慮到生產成本問題,筆者在單因素試驗篩選出最佳碳源糊精和蔗糖、最佳氮源蛋白胨以及無機鹽氯化鈉的基礎上，采用如表1所示的L9(34)正交表進行培養基優化試驗,培養基pH值為7.0,發酵溫度為28 ℃,在轉速為180 r/min的搖床中振蕩培養24 h,每個處理3次重復，以OD600值分析4因素3水平對菌體生物量的影響,以確定最佳的培養基配方[8]。

1.5發酵條件的優化

培養基初始pH值:在優化得到的培養基的基礎上,分別對培養基初始pH值、發酵溫度、發酵時間、裝液量、接種量以及轉速進行進一步的優化。用0.1 mol/LHCl和0.1 mol/L NaOH將培養基的初始pH值分別調成5、6、7、8、9、10,每個處理裝液量為150 mL,然后接種50 μL種子發酵液,在轉速180 r/min、發酵溫度28 ℃條件下培養24 h，最后測定OD600值。發酵溫度設置21、24、27、30、34、37 ℃;發酵時間設置12、36、48、60、72、96 h;裝液量設置在250 mL三角瓶中分別裝培養基50、75、100、125、150、175 mL;按體積分數將接種量設置為1%、3%、5%、7%、9%、10%;轉速設置90、120、150、180、210、240 r/min。在其他條件不變的情況下，改變某一發酵條件進行試驗,分別測定和記錄OD600值,每組試驗重復3次[9]。

表1 L9(34)正交試驗設計

1.6數據統計分析

采用Excel軟件處理數據和作圖,采用生物統計分析軟件DPS進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1培養基成分的篩選

由圖1可見：在供試的7種碳源中,當以糊精作為碳源時XZ-1的生長量最大,其發酵液的OD600值達到0.662；在其他碳源條件下XZ-1的生長量從大到小依次為蔗糖0.642、麥芽糖0.387、葡萄糖0.332、木糖0.318、檸檬酸0.210和可溶性淀粉0.177。由于以蔗糖作為碳源時XZ-1發酵液的OD600值與以糊精為碳源時的沒有極顯著差異,因此考慮用糊精和蔗糖作為復合碳源。

圖中不同大寫字母表示1%極顯著差異。

從圖2可以看出：在供試的7種氮源中,當以蛋白胨作為氮源時XZ-1的生長量最大,其OD600值高達0.825,極顯著高于其他6種氮源條件下XZ-1的生長量；在其他6種氮源下XZ-1發酵液的OD600值從大到小依次為酵母提取物0.802、酵母膏0.579、硫酸銨0.335、氯化銨0.299、硝酸銨0.275、尿素0.242,因此,選擇以蛋白胨作為最佳氮源。

圖2 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌XZ-1生長的影響

由圖3可見：在供試的7種無機鹽中,當以氯化鉀和氯化鈉作為無機鹽時,XZ-1的生長量居前兩位,其OD600值分別為0.743和0.702;在硫酸鐵、氯化鎂和氯化鈣作為無機鹽的條件下,XZ-1的生長量其次,其OD600值分別為0.581、0.578和0.548;硫酸鋅和硫酸鐵則顯著抑制XZ-1的生長。結合考慮生產成本,我們選擇氯化鈉作為無機鹽進行后續的正交試驗。

圖3 不同無機鹽對解淀粉芽孢桿菌XZ-1生長的影響

2.2優化培養基成分的正交試驗結果

以從2.1中篩選出的糊精(或蔗糖)、蛋白胨和氯化鈉分別作為最佳碳源、氮源和無機鹽,按照表1的設計進行優化培養基成分的正交試驗。由表2和表3可見,不同水平的糊精對XZ-1的生長量有一定的影響,具體表現為糊精的濃度越高,XZ-1的生長量越低,極差為0.099;不同水平的蔗糖對XZ-1的生長量也有一定的影響,隨著蔗糖濃度從5 g/L增加到10 g/L,XZ-1的生長量逐漸增加,但是隨著蔗糖濃度從10 g/L進一步增加到15 g/L,XZ-1的生長量反而下降,極差為0.071;不同水平的蛋白胨對XZ-1生長量的影響也表現為先升后降,極差為0.065; XZ-1的生長量隨著氯化鈉濃度的增加而增加,極差為0.130。結合正交試驗結果,認為菌株XZ-1的發酵培養基的最適成分為:糊精10 g/L、蔗糖5 g/L、蛋白胨10 g/L和氯化鈉7 g/L。

表2 優化發酵培養基組分的正交試驗統計結果

注：括號外為各因素的水平值，括號內為各因素的實際值(g/L)。

表3 培養基組分正交試驗評價結果(發酵液OD600值)

2.3XZ-1培養條件的優化

2.3.1 培養基的初始pH值 從圖4-1可見：在初始pH值為5、6時,XZ-1菌株的生長量居前2位；在pH值為6時,XZ-1發酵液的OD600值達到0.830,極顯著高于其他pH條件下的；隨著pH在6～10范圍內逐漸增加,發酵液的OD600值逐漸下降；當培養基初始pH值達到9以上時,該菌株的生長量極低。因此,可將發酵培養基的初始pH值調節在6左右。

2.3.2 培養溫度 從圖4-2可以看出：當培養溫度為27 ℃時,XZ-1的生長量極顯著高于其他溫度下的；XZ-1在其他幾個溫度下的發酵液生長量表現為30 ℃>24 ℃>34 ℃>21 ℃>37 ℃。所以,該菌株最佳的發酵溫度為27 ℃。

2.3.3 培養時間 圖4-3表明：XZ-1菌株在培養時間為12～36 h時,其發酵液的OD600值顯著升高,當搖培36 h時發酵液的OD600值高達1.172;當繼續增加搖培時間時,菌株的生長量逐漸下降。由此推測該菌株從36 h之后逐漸進入生長衰退期,因此,我們認為該菌株的最佳發酵時間為36 h。

2.3.4 裝液量 不同裝液量的試驗結果如圖4-4所示,在250 mL三角瓶中,XZ-1的生長量起初隨著裝液量的增加而增加,當裝液量達到100 mL時,XZ-1發酵液的OD600值最高,為0.923;此后隨著裝液量繼續增加,XZ-1發酵液的OD600值逐漸下降。說明XZ-1的生長對通氣量有一定的要求,通氣量過大或過小都不利于該菌株的生長。由此,我們認為XZ-1的最佳裝液量為在250 mL三角瓶中裝液100 mL。

2.3.5 接種量 XZ-1的生長也在一定程度上受接種量的影響,結果如圖4-5所示,當接種量從1%增加到3%時,XZ-1發酵液的OD600值逐漸上升,當接種量為3%時,XZ-1發酵液的OD600值達到最高(0.829);此后隨著接種量的繼續增加,XZ-1發酵液的OD600值逐漸下降。因此我們認為XZ-1的最佳接種量為3%。

2.3.6 轉速 從圖4-6可以看出,搖床的轉速對XZ-1的生長有較大的影響,當轉速低于150 r/min 時,該菌株的生長量較小;當轉速在150 r/min時,該菌株的生長量達到峰值,其發酵液的OD600為0.860;當轉速繼續升高后,其OD600值又逐漸下降。因此,XZ-1的最適轉速為150 r/min。

圖4 不同發酵條件對解淀粉芽孢桿菌生長的影響

3 討論與結論

發酵培養是生防菌應用推廣的工業基礎,而發酵技術是制備生物產品的重要手段,其中發酵培養基成分、發酵液的溶氧量、發酵液的pH值、發酵時間以及搖床轉速等多種因素對發酵產品均有較大的影響。近年來，關于生防菌株發酵培養基成分以及發酵條件優化的研究報道有很多[10,13],其中關于解淀粉芽孢桿菌發酵條件優化的報道也不少,如洪鵬等(2013)研究發現葡萄糖和蔗糖為解淀粉芽孢桿菌菌株HF-01生長的最佳碳源,有機氮源有利于該菌株菌體的生長，而銨態氮源不利于該菌體的生長,其最適pH值為6.0～ 6.5,最適發酵時間為48 h[14];章小洪等(2012)研究發現解淀粉芽孢桿菌菌株BW-13的最佳碳源為玉米粉,最佳氮源為蛋白胨,最佳金屬離子為Mn2+,發酵液最佳pH值為5.0,最佳裝液量為30 mL/250 mL,最佳接種量為4%,最佳發酵溫度為28 ℃,最佳轉速為200 r/min,最佳發酵時間為144 h[15]。據盧彩鴿等(2015)報道，解淀粉芽孢桿菌菌株MH71的最佳發酵培養基組成成分為玉米粉36.6 g/L,葡萄糖14.0 g/L,牛肉膏3.2 g/L,蛋白胨7.0 g/L, NaCl 1.33 g/L, K2HPO40.8 g/L, MgSO4·7H2O 0.4 g/L, CaCO38.0 g/L；其最佳發酵條件為發酵溫度30 ℃,轉速200 r/min,培養基初始pH值7.0,最佳接種量3%,最佳裝液量100 mL/500 mL,最佳發酵時間72 h[16]。這些結果與本研究得出的部分結果有所差異,可見,由于菌株的來源不同,菌株本身的生物學特性存在差異,其發酵培養條件不能一概而論。因此,選擇適合菌株本身生長的培養基成分和發酵條件,有利于增加菌體產量,使菌株的生防潛力得到充分的發揮。

本文采用單因素試驗設計和正交試驗設計方法,對解淀粉芽孢桿菌菌株XZ-1的發酵培養基配方和發酵條件進行了優化,結果表明：XZ-1發酵培養基的最佳碳源為糊精,最佳氮源為蛋白胨,最佳無機鹽為氯化鉀；最佳培養基組分為糊精10 g/L,蔗糖5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉7 g/L; XZ-1的最佳發酵條件為培養基初始pH值6,發酵溫度27 ℃,發酵時間36 h,裝液量100 mL/250 mL,接種量3%,轉速150 r/min。

此外,受環境和不同發酵條件的影響,生防菌的抑菌能力往往存在較大的差異。下一步我們還將開展不同發酵培養基成分以及不同發酵條件對XZ-1發酵液抑菌活性的影響研究,為該生防菌株的開發應用提供理論依據。

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(責任編輯:黃榮華)

OptimizationofFermentationConditionsforBacillusamyloliquefaciensStrainXZ-1

YANG Dong-jing, ZHAO Yong-qiang, SUN Hou-jun, ZHANG Cheng-ling, XU Zhen, XIE Yi-ping*

(Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area in Jiangsu / Key Laboratory of Sweet Potato Biology and Genetic Improvement of Agricultural Ministry, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xuzhou 221131, China)

S482.292

A

1001-8581(2017)10-0035-05

2017-06-02

國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-11-B-09)。

楊冬靜(1983─),女,四川射洪人,助理研究員,碩士,主要從事植物病理學研究。*通訊作者:謝逸萍。