五氯酚對(duì)好氧活性污泥中不同酶活性的影響

汪靈偉，汪皓琦，刑一明，董玉瑛，鄒學(xué)軍，張瑾?jiǎng)?/p>

(1.大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116605；2.美國(guó)康寧公司 生命科學(xué)部，美國(guó) 波士頓 01801 )

五氯酚對(duì)好氧活性污泥中不同酶活性的影響

汪靈偉1，汪皓琦1，刑一明1，董玉瑛1，鄒學(xué)軍1，張瑾?jiǎng)?

(1.大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116605；2.美國(guó)康寧公司 生命科學(xué)部，美國(guó) 波士頓 01801 )

以五氯酚為研究對(duì)象，采用分光光度法測(cè)定其對(duì)城市污水處理廠好氧活性污泥中的脲酶、轉(zhuǎn)化酶、脫氫酶活性的影響。結(jié)果表明，隨著五氯酚暴露濃度的增大，脲酶活性總體呈上升趨勢(shì)；轉(zhuǎn)化酶活性先升高后降低，暴露時(shí)間為0.5 h，轉(zhuǎn)化酶升高率達(dá)到最大值49.3%；暴露15 h后轉(zhuǎn)化酶活性開(kāi)始呈現(xiàn)降低態(tài)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)最大暴露時(shí)間25 h時(shí)降低率達(dá)到76.8%。脫氫酶活性則大多呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，在暴露0.5 h時(shí)其酶活性隨五氯酚濃度變化呈明顯負(fù)相關(guān)，酶活性降低率為52%，之后脫氫酶活性被抑制情況呈現(xiàn)平緩趨勢(shì)。綜合生理生化反應(yīng)指標(biāo)的敏感度和分析方法的精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)，五氯酚對(duì)轉(zhuǎn)化酶影響幅度大且分析精密度高，而脫氫酶響應(yīng)快，可作為急性毒性應(yīng)激敏感指標(biāo)。

五氯酚；好氧活性污泥；脲酶；轉(zhuǎn)化酶；脫氫酶

Abstract:Taking pentachlorophenol as the research object, its effects on urease, invertase and dehydrogenase activities in aerobic activated sludge from the municipal sewage plant were measured using spectrophotometry. The results demonstrated that with the increase of the exposure concentration of pentachlorophenol, urease activity overall was increased, while invertase activity was increased, followed by a decrease. The invertase was increased by 49.3% at 0.5 hours of exposure, and decreased at 15 hours, whose inhibition rate reached to 76.8% at 25 hours. The dehydrogenase activity was initially decreased clearly and then remained inhibiting slowly. The dehydrogenase activity was negatively correlated with increasing pentachlorophenol concentrations and the dehydrogenase activity was decreased by 52% within 0.5 hours of exposure. Based on evaluation of sensitivity of physiological and biochemical reactions and precision of analytical method, we observed high analytical precision of robust effect of invertase and rapid response of dehydrogenase to pentachlorophenol. Therefore, these two enzymes can be used as acute toxicity stress sensitive indicators.

Keywords:pentachlorophenol; aerobic activated sludge; urease; invertase; dehydrogenase

新興污染物是一種以低微濃度就能影響生物生存或抑制生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)，這類(lèi)污染物來(lái)源廣、排放量大，造成其在環(huán)境中長(zhǎng)期存在。抗生素、抗炎藥、消毒劑、除草殺蟲(chóng)用劑等藥品和個(gè)人護(hù)理品PPCPs(Parmaceuticals and Personal Care Products)是與人類(lèi)關(guān)系密切、應(yīng)用廣泛、種類(lèi)繁多的一大類(lèi)新興污染物[1]。受限于新興污染物的處理技術(shù)和效率，這些物質(zhì)將進(jìn)入污水處理廠、受納水體和飲用水源地，甚至水管水。抗生素、化肥農(nóng)藥、產(chǎn)品添加劑等類(lèi)型的新興污染物進(jìn)入污水處理廠，可能對(duì)污水處理廠活性污泥中的微生物活性產(chǎn)生抑制作用，甚至導(dǎo)致其死亡，從而影響污水處理效果的穩(wěn)定性和出水水質(zhì)。有關(guān)PPCPs對(duì)活性污泥中微生物抑制情況的研究備受關(guān)注。

五氯酚是一種常見(jiàn)的易電離、難溶于水的氯代芳香族有機(jī)污染物，自20世紀(jì)30年代以來(lái)，五氯酚及其鈉鹽在全球范圍內(nèi)被廣泛用作殺菌劑、除草劑、殺蟲(chóng)劑和木材防腐劑[2]。目前，國(guó)內(nèi)外的研究多集中于五氯酚在污水處理廠中的降解效率、代謝產(chǎn)物及其毒性減排的情況，而對(duì)城市污水處理廠污泥活性影響的研究較少[3-5]。本文以五氯酚為研究對(duì)象，測(cè)定了其對(duì)好氧活性污泥中脲酶、轉(zhuǎn)化酶、脫氫酶活性的影響，為新興污染物生物處理工藝設(shè)備的運(yùn)行維護(hù)和合理調(diào)控奠定了基礎(chǔ)[6-8]。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

UV-1000分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；TDZ5-WSD多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；THZ-B臺(tái)式恒溫振蕩器(常州諾基儀器有限公司)；PHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；溶解氧測(cè)定儀(北京哈納科儀科技有限公司)。

甲苯、10%尿素溶液、檸檬酸緩沖溶液(pH 6.7)、1%次氯酸鈉；磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(pH 5.5)、10%蔗糖基質(zhì)溶液、3,5-二硝基水楊酸溶液、甲醛、丙酮、硫化鈉、2,3,5-氯化三苯基四氮唑、三羥甲基氨基甲烷等試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)中所用活性污泥均取自大連某污水處理廠的曝氣池，其接納污水中大部分是生活污水。曝氣池中污泥混合液懸浮固體(MLSS)質(zhì)量濃度為3 000 mg·L-1,揮發(fā)性懸浮物(VSS)約為0.7 mg·L-1，污泥容積指數(shù)(SVI)在80～120 mg·g-1。

1.2 脲酶的測(cè)定方法

應(yīng)用苯酚鈉比色法，將污泥懸濁液與適量甲苯充分混合，加入10%尿素溶液和檸檬酸緩沖溶液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出后將混合液過(guò)濾。取適量濾液依次加入一定量苯酚鈉和次氯酸鈉。將混合液混勻后靜置顯色，溶液呈現(xiàn)靛藍(lán)色。稀釋后在578 nm下測(cè)其吸光度。以24 h后1 g活性污泥中NH3-N的毫克數(shù)表示脲酶活性(Ure):

(1)

式中，a為樣品吸光度值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3-N毫克數(shù)；v為顯色液體積；n為分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積；m為烘干土種的質(zhì)量(g)。

1.3 轉(zhuǎn)化酶的測(cè)定方法

應(yīng)用3,5-二硝基水楊酸法，取一定量的污泥懸液加入適量磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，10%蔗糖基質(zhì)溶液和少量甲苯溶液，將此混合液置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過(guò)濾后取少量濾液，加入適量3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴鍋中加熱，冷卻，稀釋后在540 nm下測(cè)吸光度值。轉(zhuǎn)化酶活性(Invert)以1 g烘干污泥24 h生成葡萄糖毫克數(shù)表示。

(2)

式中，a表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的葡萄糖毫克數(shù)；n為分取倍數(shù)；m為烘干土樣。

1.4 脫氫酶的測(cè)定方法

DHA=A×B×C。

(3)

式中，A為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得TTC濃度；B為培養(yǎng)矯正時(shí)間；C為稀釋倍數(shù)。

1.5 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

為了減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酶活性的自然衰減對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中控制活性污泥中酶活性的自然衰減率在15%范圍內(nèi)，確定實(shí)驗(yàn)的暴露時(shí)間為0～25 h。五氯酚在環(huán)境中的最大暴露濃度為120 mg·L-1，確定實(shí)驗(yàn)過(guò)程中五氯酚的暴露濃度梯度范圍為0～120 mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 五氯酚對(duì)脲酶活性的影響

測(cè)定不同條件下污泥溶液吸光度的變化，求得脲酶活性。不同時(shí)間下，受五氯酚脅迫的活性污泥中脲酶活性變化情況如圖1。

圖1 不同五氯酚濃度梯度脅迫下脲酶活性動(dòng)力學(xué)變化情況

在相同時(shí)間條件下，好氧活性污泥中脲酶的活性隨五氯酚濃度的升高總體呈上升趨勢(shì)，五氯酚濃度在0～120mg·L-1范圍內(nèi)，脲酶活性最大上升率為41.4%，最小上升率為16.9%。脲酶是一種水解酶，活性污泥對(duì)污染物的降解很大程度上依賴(lài)其中的水解酶[9-10]，當(dāng)污染物進(jìn)入城市污水廠，活性污泥中水解酶活性上升。隨著暴露時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，相同五氯酚暴露濃度下，好氧活性污泥中脲酶活性變化不大。

2.2 五氯酚對(duì)轉(zhuǎn)化酶活性的影響

測(cè)定不同條件下污泥溶液吸光度的變化，求得轉(zhuǎn)化酶活性。不同時(shí)間下，受五氯酚的脅迫，活性污泥中轉(zhuǎn)化酶活性變化情況如圖2。

圖2 不同五氯酚濃度梯度脅迫下轉(zhuǎn)化酶活性動(dòng)力學(xué)變化情況

活性污泥與五氯酚暴露0.5 h時(shí)，轉(zhuǎn)化酶活性隨五氯酚濃度的增大呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，變化曲線如圖3。

圖3 0.5 h轉(zhuǎn)化酶活性隨五氯酚濃度變化曲線

上升率最大值為84%。污染物中微生物的一種自我保護(hù)機(jī)制[11]可能會(huì)造成活性污泥中轉(zhuǎn)化酶的應(yīng)激反應(yīng)。

隨暴露時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化酶活性的升高率逐漸降低，暴露時(shí)間15～25 h，轉(zhuǎn)化酶活性呈現(xiàn)出降低趨勢(shì)，變化曲線如圖4。

圖4 25 h轉(zhuǎn)化酶活性隨五氯酚濃度變化曲線

暴露時(shí)間為25 h降低率達(dá)到了最大值77%。可能原因是五氯酚的存在影響了微生物的代謝過(guò)程，超出了其承受范圍，導(dǎo)致自身活性下降。相同暴露濃度下，轉(zhuǎn)化酶對(duì)五氯酚暴露時(shí)間的改變很敏感，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化酶活性呈現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)。綜合生理生化反應(yīng)指標(biāo)的敏感度和分析方法的精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)，五氯酚對(duì)轉(zhuǎn)化酶影響幅度大且分析精密度高。

2.3 五氯酚對(duì)脫氫酶的影響

測(cè)定不同條件下污泥溶液吸光度的變化，求得脫氫酶活性。不同時(shí)間下，受五氯酚的脅迫活性污泥中脫氫酶活性變化情況如圖5。

圖5 不同五氯酚濃度梯度脅迫下脫氫酶活性動(dòng)力學(xué)變化情況

活性污泥與五氯酚暴露時(shí)間為0.5 h，脫氫酶活性隨五氯酚濃度變化呈負(fù)相關(guān)，變化曲線如圖6。

圖6 五氯酚不同濃度梯度下暴露0.5h脫氫酶活性變化曲線

脫氫酶活性降低率為52%，脫氫酶活性變化范圍較大；0.5 h后，脫氫酶活性逐漸恢復(fù)，隨五氯酚濃度的升高變化幅度減小，脫氫酶屬于急性毒性應(yīng)激敏感指標(biāo)。

3 結(jié) 論

(1) 五氯酚濃度影響了活性污泥中脲酶、轉(zhuǎn)化酶和脫氫酶的活性。隨著暴露濃度的增大，脲酶活性升高，轉(zhuǎn)化酶活性先升高后降低，脫氫酶活性先降低后保持平穩(wěn)。

(2) 暴露時(shí)間對(duì)脲酶、脫氫酶活性影響較小，對(duì)轉(zhuǎn)化酶活性影響較大。綜合生理生化反應(yīng)指標(biāo)的敏感度和分析方法的精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)，五氯酚對(duì)轉(zhuǎn)化酶影響幅度大且分析精密度高，而脫氫酶響應(yīng)快，可作為急性毒性應(yīng)激敏感指標(biāo)。

(3) 五氯酚的存在導(dǎo)致污水處理廠活性污泥中微生物活性受到抑制，酶活性受到不同程度的影響，將影響城市污水處理廠的出水水質(zhì)。

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(責(zé)任編輯 趙環(huán)宇)

EffectsofPentachlorophenolonVariousEnzymeActivitiesinAerobicActivatedSludge

WANGLing-wei1,WANGHao-qi1,XINGYi-ming1,DONGYu-ying1,ZOUXue-jun1,ZHANGJin-gang2

(1.School of Environment and Resources, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China;2. Department of Life Science, Corning Incorporated, Boston 01801, USA)

X703

A

2017-06-07；

2017-06-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21477001)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(DC201502070302)。

汪靈偉(1993-)，男，云南麗江人，大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院碩士研究生，主要從事新興污染物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究。

董玉瑛(1968-)，女，遼寧錦州人，教授，博士，學(xué)校優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人，主要從事環(huán)境化學(xué)與教學(xué)研究，E-mail:dongy@dlnu.edu.cn。

2096-1383(2017)05-0438-04