火針對脊髓損傷大鼠神經干細胞 Wnt/β-catenin通路基因表達的離體研究

徐家淳,趙志恒,程素利,王雪,焦召華,蔡志敏,李婷,時旭平,周震,劉保紅,李巖

(1.天津中醫藥大學,天津 300193;2.天津市公安醫院,天津 300042;3.河北科技師范學院,秦皇島 066000;4.天津中醫藥大學第二附屬醫院,天津 300150)

火針對脊髓損傷大鼠神經干細胞 Wnt/β-catenin通路基因表達的離體研究

徐家淳1,趙志恒1,程素利1,王雪1,焦召華2,蔡志敏3,李婷1,時旭平1,周震4,劉保紅2,李巖2

(1.天津中醫藥大學,天津 300193;2.天津市公安醫院,天津 300042;3.河北科技師范學院,秦皇島 066000;4.天津中醫藥大學第二附屬醫院,天津 300150)

目的 觀察火針對脊髓損傷Wnt/β-catenin通路上神經干細胞Wnt、β-catenin基因的調控作用。方法 將60只SD雌性大鼠隨機分為空白組5只、假手術組5只、模型組25只、火針組25只,模型組和火針組大鼠又分為1 d組、3 d組、7 d組、10 d組和14 d組;采用改良的Allen's法對模型組和火針組造模,觀察各組BBB評分,Wnt3a和β-catenin基因表達變化。結果 在7 d、10 d時模型組和火針組BBB評分明顯高于同組前一時相,差異具有統計學意義(P＜0.05);火針組大鼠在治療后各時間點BBB評分明顯高于模型組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。在7 d、10 d時模型組和火針組Wnt3a基因表達量較同組前一時相均增加(P＜0.05);在7 d、10 d時火針組Wnt3a基因表達量高于模型組,差異具有統計學意義(P＜0.05);β-catenin基因表達水平變化趨勢與Wnt3a基本一致。結論 火針可調控脊髓損傷神經干細胞Wnt3a、β-catenin基因表達。

針刺療法;火針;脊髓損傷;Wnt3a基因;β-catenin基因;大鼠

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種嚴重的神經系統疾病,可引起直接性機械損傷和繼發性損傷級聯反應,往往導致永久性損傷[1]。SCI后星形膠質細胞、小神經膠質細胞和少突膠質細胞的反應性增生阻礙了脊髓再生,因此 SCI后促進神經元再生是早期治療SCI的關鍵。而適當誘導神經干細胞(neural stem cells,NSCs)增殖并向神經元分化是減輕 SCI病理性損傷、促進其神經再生與修復的一種潛在治療方法[2-3]。NSCs向神經元的分化受多種因素影響和制約,并由多條信號轉導通路所介導,其中 Wnt/β-catenin信號途徑是一條經典的信號途徑。該信號途徑對NSCs的增殖和分化有著重要的作用,給目前 SCI的治療帶來了希望[4-5]。如果可刺激該信號在SCI后高表達,促使NSCs向神經元分化,對恢復脊髓功能意義重大。本研究擬建立 SCI大鼠模型,在離體狀態下觀察火針對不同時點SCI大鼠Wnt/β-catenin通路基因表達的影響,為揭示火針治療SCI的機理提供部分實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康SPF級孕14 d SD大鼠2只。2月齡雌性SD大鼠60只,體重260 g左右;由中國食品藥品檢定研究所提供[許可證號 SCXK(京)2009-0017],采用隨機數字表法隨機分為空白組5只、假手術組5只、模型組25只、火針組25只;模型組和火針組又分別分為1 d組、3 d組、7 d組、10 d組、14 d組各5只。

1.2 模型制備及行為學評分

采用本課題組改良的 Allen's法[6]對模型組和火針組大鼠建立 SCI模型,假手術組大鼠僅切除 T9、T10椎板,術后小心護理飼養,每天擠壓排尿3次。造模前及各時間點對各組大鼠進行BBB運動評分[7]。

1.3 干預方法

造模成功后即對火針組SCI大鼠采用速刺法進行火針針刺,針刺T7,T8及T11,T12棘突間隙旁的華佗夾脊穴;之后每隔24 h治療1次。

1.4 觀察指標

1.4.1 行為學評分

造模前及各時間點對各組大鼠進行BBB評分[7]。

1.4.2 血清制備

空白組和假手術組大鼠在24 h后,模型組和火針組大鼠于相應時間點(1 d,3 d,7 d,10 d,14 d)麻醉后于無菌條件下腹主動脈采血,分離血清。56℃滅活30 min,220 nm濾膜濾過除菌,-20℃保存備用。

1.4.3 神經干細胞培養與鑒定

無菌條件下取SD胎鼠,D-Hanks液充分漂洗后,在解剖顯微鏡下剝離皮膚、肌肉等組織,用眼科剪剪碎脊髓后,0.25%胰蛋白酶消化,吸管吹打,200目銅網過濾,離心,棄上清,再轉移到 DMEM/F12(1:1)加 B27和bFGF(20 ng/mL)的無血清培養基,以細胞濃度為5×105個/mL接種入 24孔培養板中培養,每孔加入細胞懸液500 μL。置入37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。此后每3 d半量換液1次,每7 d機械分離克隆傳代1次,方法同前。傳代培養純化的細胞經Nestin鑒定,顯示 Nestin免疫反應陽性,表明所培養的細胞為神經干細胞。

1.4.4 火針對神經干細胞Wnt3a及β-catenin基因表達水平影響的檢測

離心收集傳代培養 3代的 NSCs,將細胞接種于 6孔培養板,接種密度為 2×105個/mL。將 NSCs按培養基中所含血清成分的不同共分空白組、假手術組、模型組及火針組,其中模型組和火針組根據時間點不同分為1 d組、3 d組、7 d組、10 d組、14 d組,共12種血清。各組培養基均為含10%濃度SD大鼠不同血清成分的 DMEM/F12基礎培養基(不含 B27、rhEGF和rhbFGF),每3孔為同一血清成分培養液。不同血清成分干預神經干細胞后培養72 h,采用RT-PCR法檢測各組細胞中 Wnt通路中 Wnt3a及β-catenin目的基因mRNA表達量的變化。

1.5 統計學方法

采用SPSS19.0軟件對數據進行統計學處理,計量資料服從正態分布以均數±標準差表示,不服從以[中位數,(四分位間距)]表示,方差齊,兩組比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠BBB評分比較

各時間點評分顯示模型組和火針組大鼠BBB評分逐漸升高,其中模型組在7 d、10 d和14 d時評分明顯高于前一時相,差異具有統計學意義(P＜0.05);火針組在7 d和10 d時評分明顯高于前一時相,差異具有統計學意義(P＜0.05);而火針組大鼠在治療后各時間點評分明顯高于模型組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠BBB評分情況 [M,(Q)/±s,分]

表1 各組大鼠BBB評分情況 [M,(Q)/±s,分]

注:與模型組比較1)P＜0.05;與同組前一時相比較2)P＜0.05

組別n造模前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d空白組 5 21.00,(0.00) 21.00,(0.00) - - - -假手術組 5 21.00,(0.00) 21.00,(0.00) - - - -模型組 5 21.00,(0.00) 0.00,(0.00) 1.40±0.55 4.80±0.842)6.00±0.712)7.6±0.552)火針組 5 21.00,(0.00) 0.00,(0.00) 2.40±0.891)7.40±0.551)2)8.80±0.841)2)9.4±0.551)

2.2 火針對神經干細胞Wnt3a及β-catenin基因表達水平的影響

不同干預條件處理神經干細胞72 h后,與假手術組比較,1 d時模型組和火針組Wnt3a基因表達量明顯降低,差異具有統計學意義(P＜0.05),且降低的趨勢持續到3 d;在7 d、10 d時模型組和火針組Wnt3a基因表達量均增加,較前一時間點差異均有統計學意義(P＜0.05);在7 d、10 d時火針組Wnt3a基因表達量均比高于模型組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見表 2。β-catenin基因表達水平變化趨勢與 Wnt3a基本一致。詳見表3。

表2 各組大鼠不同時相Wnt3a基因表達 (±s)

表2 各組大鼠不同時相Wnt3a基因表達 (±s)

注:與假手術組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與同組前一時相比較3)P＜0.05

組別n1 d 3 d 7 d 10 d 14 d空白組 3 1.10±0.26 - - - -假手術組 3 1.00±0.00 - - - -模型組 3 0.63±0.041)0.41±0.03 1.12±0.153)1.42±0.133)1.34±0.08火針組 3 0.56±0.121)0.43±0.04 1.50±0.032)3)1.80±0.142)3)1.45±0.133)

表3 各組大鼠不同時間點β-catenin基因表達 (±s)

表3 各組大鼠不同時間點β-catenin基因表達 (±s)

注:與假手術組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與同組前一時相比較3)P＜0.05

組別n1 d 3 d 7 d 10 d 14 d空白組 3 0.95±0.1 - - - -假手術組 3 1.00±0.0 - - - -模型組 3 0.32±0.031)0.21±0.03 0.53±0.143)0.83±0.133)1.12±0.133)火針組 3 0.37±0.121)0.29±0.06 1.05±0.052)3)1.42±0.162)3)1.26±0.24

3 討論

SCI后不僅降低了患者的生活質量,而且帶來了沉重的經濟負擔,且隨著經濟水平的高速發展、交通事故增多等原因,SCI發生率逐年增高。然而SCI后出現的組織水腫、變性、壞死、神經細胞凋亡阻礙了脊髓神經功能的修復,因此研究探索行之有效的治療方法刻不容緩。近年來研究發現,內源性神經干細胞直接參與了神經系統損傷的自然修復過程,SCI后神經干細胞的激活、增殖、分化成為SCI后神經功能恢復的關鍵。

Wnt信號通路是一類廣泛存在于多細胞真核生物中高度保守的復雜的信號通路,在神經干細胞的增殖、分化中發揮重要作用[8],其中 Wnt/β-catenin信號通路是最經典的一條通路,在神經干細胞的增殖分化和軸突導向中具有關鍵作用[9]。Wnt3a不僅在發育中的脊髓神經祖細胞具有促有絲分裂效應[10],還可在脊髓背側神經元的特化中發揮重要作用[11],增加 SCI后的神經元數量,促進軸突傳導及神經功能的改善[12]。現有研究顯示針灸具有調控 Wnt/β-catenin信號通路的作用[13-14],但研究多集中于骨質疏松癥、腦梗死等,而無與SCI的相關研究。

火針為傳統針灸療法的一種,不僅可促進 SCI模型大鼠神經干細胞增殖[15],而且具有抑制神經細胞凋亡作用[16]。本次研究采用RT-PCR法離體研究了火針對SCI后Wnt/β-catenin信號通路中關鍵因子Wnt3a和β-catenin基因表達的影響,研究發現SCI后Wnt3a和β-catenin的基因表達量均顯著降低,而在7 d后呈現高表達,這種變化可能有助于 NSCs向神經細胞分化;而經火針療法干預后的Wnt3a和β-catenin的基因表達量在7 d和10 d時均明顯高于模型組,表明火針療法具有調控Wnt3a和β-catenin基因表達的作用,揭示了火針治療SCI的部分機制。基于此,筆者推測火針可通過調控Wnt通路促進神經干細胞增殖分化達到修復SCI的目的,本課題組將會進一步對此進行研究探索,為火針治療SCI提供實驗依據。

[1]Lim PA, Tow AM. Recovery and regeneration after spinal cord injury: a review and summary of recent literature[J].Ann Acad Med Singapore, 2007,36(1):49-57.

[2]Cheng Z, Bosco DB, Sun L,et al. Neural stem cellconditioned medium suppresses inflammation and promotes spinal cord injury recovery[J].Cell Transplant,2017,26(3):469-482.

[3]Zhao Y, Zuo Y, Jiang J,et al. Neural stem cell transplanttation combined with erythropoietin for the treatment of spinal cord injury in rats[J].Exp Ther Med, 2016,12(4):2688-2694.

[4]Libro R, Giacoppo S, Bramanti P,et al. Is the Wnt/βcatenin pathway involved in the anti-inflammatory activity of glucocorticoids in spinal cord injury?[J].Neuroreport, 2016,27(14):1086-1094.

[5]Strand NS, Hoi KK, Phan TM,et al. Wnt/β-catenin signaling promotes regeneration after adult zebrafish spinal cord injury[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,477(4):952-956.

[6]孫立明,李巖,周震,等.火針對脊髓損傷模型大鼠凋亡相關蛋白表達的影響[J].針灸臨床雜志,2010,26(12):49-53.

[7]Scheff SW, Saucier DA, Cain ME. A statistical method for analyzing rating scale data: the BBB locomotor score[J].J Neurotrauma, 2002,19(10):1251-1260.

[8]Dickinson ME, McMahon AP. The role of Wnt genes in vertebrate development[J].Curr Opin Genet Dev, 1992,2(4):562-566.

[9]Ring A, Kim YM, Kahn M. Wnt/catenin signaling in adult stem cell physiology and disease[J].Stem Cell Rev,2014, 10(4):512-525.

[10]Megason SG, McMahon AP. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS[J].Development, 2002,129(9):2087-2098.

[11]Muroyama Y, Fujihara M, Ikeya M,et al. Wnt signaling plays an essential role in neuronal specification of the dorsal spinal cord[J].Genes Dev, 2002,16(5):548-553.

[12]Yin ZS, Zu B, Chang J,et al. Repair effect of Wnt3a protein on the contused adult rat spinal cord[J].Neurol Res, 2008,30(5):480-486.

[13]Chen B, Tao J, Lin Y,et al. Electro-acupuncture exerts beneficial effects against cerebral ischemia and promotes the proliferation of neural progenitor cells in the cortical peri-infarct area through the Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Int J Mol Med, 2015,36(5):1215-1222.

[14]Zhang YM, Dai QF, Chen WH,et al. Effects of acupuncture on cortical expression of Wnt3a, β-catenin and Sox2 in a rat model of traumatic brain injury[J].Acupunct Med, 2016,34(1):48-54.

[15]李巖,周震,程素利,等.火針干預脊髓損傷大鼠后血清對神經干細胞增殖分化的影響[J].天津中醫藥,2013,30(1):25-27.

[16]孫立明,李巖,周震,等.火針對脊髓損傷模型大鼠凋亡細胞的影響[J].針灸臨床雜志,2011,27(1):58-61.

In Vitro Study on Fire Needling and the Expression of Wnt/β-catenin Pathway Genes in Neural Stem Cells in Rats with Spinal Cord Injury

XU Jia-chun1,ZHAO Zhi-heng1,CHENG Su-li1,WANG Xue1,JIAO Zhao-hua2,CAI Zhi-min3,LI Ting1,SHI Xu-ping1,ZHOU Zhen4,LIU Bao-hong2,LI Yan2. 1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin300193,China; 2.Tianjin Public Security Hospital,Tianjin300042,China; 3.Hebei Normal University of Science and Technology,Qinhuangdao066000,China; 4.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital,Tianjin300150,China

Objective To investigate the regulating effect of fire needling on Wnt and β-catenin genes of Wnt/β-catenin pathway in neural stem cells in spinal cord injury. Methods Sixty female SD rats were randomly allocated, including 5 rats to a blank group, 5 rats to a sham operation group, 25 rats to a model group and 25 rats to a fire needling group. The model and fire needling groups of rats were again separately divided into 1 d, 3 d, 7 d, 10 d and 14 d groups. A model was made using modified Allen’s method in the model and fire needling groups. The BBB score was recorded and the expressions of Wnt and β-catenin genes were determined in every group. Results In the model and fire needling groups, the BBB scores were significantly higher at 7 and 10 days than at the previous time point and there was a statistically significant difference (P＜0.05). The BBB score at every time point after treatment was significantly higher in the fire needling group than in the model group and there was a statistically significant difference(P＜0.05). Wnt3a gene expressions increased in the model and fire needling groups at 7 and 10 days compare with theprevious time point (P＜0.05). At 7 and 10 days, Wnt3a gene expression was higher in the fire needling group than in the model group and there was a statistically significant difference (P＜0.05). The changing tendency of β-catenin gene expression levels was basically the same as that of Wnt3a’s. Conclusion Fire needling can modulate the expressions of Wnt3a and β-catenin genes in neural stem cells in spinal cord injury.

Acupuncture therapy; Fire needling; Spinal cord injury; Wnt3a gene; β-catenin gene; Rats

R2-03

A

2017-04-11

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.09.1121

1005-0957(2017)09-1121-04

國家自然科學基金面上項目(81373839)

徐家淳(1989—),男,2015級博士生,Email:xujiachunzhu@163.com

李巖(1970—),男,主任醫師,博士,Email:liyan66950@sina.com