miRNA499在小細胞肺癌患者血清和肺泡灌洗液中的表達分析

周鳳麗，馮定云，鄒小玲，吳少珠，劉燕飛 （中山大學附屬第三醫院呼吸科，廣東廣州510630）

miRNA499在小細胞肺癌患者血清和肺泡灌洗液中的表達分析

周鳳麗，馮定云，鄒小玲，吳少珠，劉燕飛 （中山大學附屬第三醫院呼吸科，廣東廣州510630）

目的：探討miRNA499能否作為早期診斷小細胞肺癌（SCLC）的分子標志物．方法：收集26例SCLC患者的血清、肺泡灌洗液以及20例非肺癌呼吸疾病患者的血清，檢測其RNA濃度、RT逆轉錄后cDNA的濃度；同時檢測SCLC患者血清以及肺泡灌洗液中miRNA499的相對表達．結果：①SCLC患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499的表達水平均明顯升高；②非肺癌呼吸疾病患者幾乎不表達或者不表達 miR?NA499．結論：miRNA499的檢測有可能作為臨床SCLC的早期診斷指標和基因治療靶點．

肺癌；miRNA499；分子標志物

0 引言

肺癌已成為人類因癌癥死亡的主要原因［1－2］．肺癌分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer， NSCLC），其中15%～20%為SCLC．SCLC血行轉移早，手術機會少，5年生存率不足10%［2］．因此早期診斷才是臨床有效治療SCLC的關鍵．目前對NSCLC分子標志物的研究較多，SCLC是否也有相應的早期診斷的分子標志物呢？MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小為20～25個核苷酸．miRNAs已在許多細胞代謝過程中發揮重要作用，如發育、增殖、分化和凋亡．循環miRNAs已被提議作為新興的生物標志物，如癌癥、糖尿病和心血管疾病，包括急性心肌梗死（acute myocardial infarction， AMI）［3］．

目前研究證明miRNAs在癌癥發生發展中發揮重要的生物學效應，如miRNA499的表達與肝癌密切相關［4－5］．本研究通過檢測SCLC患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499的表達，明確miRNA499能否作為早期診斷SCLC的分子標志物．

1 資料和方法

1．1 一般資料 收集中山大學附屬第三醫院2015－01／2016－05住院或門診的SCLC患者26例，其中男14例，女12例，中位年齡45（30～65）歲，未經任何手術治療以及放、化療，均經病理確診．對照組為非肺癌呼吸疾病患者20例，均為同期中山大學附屬第三醫院接受支氣管鏡檢查的患者．

1．2 標本采集 血清采集使用一次性真空采血管（惰性分離膠促凝管），采集受試者外周血標本5 mL，分離血清，吸取1 mL血清于1．5 mL離心管中，將血清3000 g離心10 min，后將上清液置入新的離心管中，置－80℃低溫保存．肺泡灌洗液收集使用olympus BF?1T260電子支氣管鏡，SCLC患者取荷瘤肺葉灌洗，對照組均取右中葉灌洗，以37℃的無菌生理鹽水150 mL灌洗，回收灌洗液，取樣 10 mL，3000 g，離心5 min、加入250 μL生理鹽水保存．

1．3 血清及肺泡灌洗液中RNA的提取與RT?PCR

采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，按照常規Trizol提取操作．血清取 250 μL，加入 1 mL Trizol．生理鹽水溶解的肺泡灌洗液沉淀上清250 μL，加入1 mL Tr?izol，提取方法按照常規Trizol提取．miRNA499上游引物和下游引物序列均由廣州銳博公司提供（該公司陳述未公開上述引物，需要者可以向其索取）．檢測按實驗室常規方法進行PCR擴增．全部取2 μL的cDNA 用于 RT 反應條件：42℃，15 min，85℃，1 min．試劑購自 Promega公司，定量 PCR采用的體系為：25XdNTPs 2 μL，10Xbuffer 5 μL，上下游引物各10 pmol，Pfu 酶 0．5 μL，濃度參見試劑盒說明書，模板2 μL，加三蒸水至總體積 50 μL，該試劑盒為 Super?Real PreMix Plus（SYBR Green），購自北京天根（FP205?01）；擴增條件為：預變性 94℃ 5 min，進入循環，變性 94℃ 15 min，退火60℃ 20 s，延伸72℃ 10 s，40個循環后，72℃延伸5 min相對拷貝數比值計算，依據2△CT法計算各組miR499的相對表達量［10］．

1．4 統計學處理 采用SPSS16．0軟件進行數據分析．正態分布計量資料以±s表示，采用 t檢驗，P＜0．05表示差異有統計學意義．

2 結果

2．1 兩組患者血清和肺泡灌洗液中RNA濃度測定

本研究對RNA進行濃度測定和A260／280比值測定．正常肺泡盥洗液和血清中RNA含量比肺癌患者少很多，其原因不詳．但是其提取RNA的A260／280比值均可以滿足下一步實驗的需要（表1）．

表1 血清和肺泡灌洗液總RNA濃度和A260／280比值對照表

2．2 miRNA499 PCR溶解溫度曲線 本研究將miRNA499a的引物進行PCR，發現引物具備特異性，僅有單一的峰值，說明miRNA499的引物具有特異性（圖 1）．

圖1 miR499PCR溫度溶解曲線

2．3 肺癌患者血清和肺泡灌洗液以及非肺癌呼吸疾病患者血清的PCR擴增曲線 本研究對肺癌患者血清、肺泡灌洗液以及非肺癌呼吸疾病患者血清進行PCR檢測．結果顯示，曲線呈“倒S形”，提示PCR擴增是標準的擴增曲線，說明miRNA499PCR擴增過程是特異性指數擴增（圖2～4）．

圖2 血清標本的擴增曲線

圖3 肺泡灌洗液的擴增曲線

圖4 陰性對照的擴增曲線

2．4 兩組患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499表達量比較 對肺癌患者和非肺癌呼吸疾病患者（對照組）血清進行取樣250 μL，提取總RNA；同樣，對生理鹽水溶解的肺泡灌洗液標本，也吸取250 μL．值得注意的是，肺泡灌洗液最初來自臨床，體積是10 mL，對其高速離心后，丟棄上清，加250 μL生理鹽水溶解．然后，取總RNA，該總RNA血清和灌洗液中包含了總miRNA．最后，用20 μL無核酸酶的水溶解，取2 μL反轉錄成 cDNA，PCR 上樣量 2 μL．qPCR 相對定量的依據原理是：一定血清或肺泡灌洗液體積內miR499拷貝數的變化．其原因如下：①沒有合適的恒定表達的內參；②檢測樣品非腫瘤組織，因為血清或灌洗液中即使有U6，無法分辨是腫瘤來源的還是免疫細胞來源的．通過對血清和灌洗液的PCR結果進行分析，縱坐標表示倍數變化．具體計算方式：患者樣品PCR擴增的Ct值減去對照組Ct值，公式：2＾－（Ct患者－Ct對照），Ct表示定量 PCR 儀上擴增曲線Ct值．其結果提示肺癌患者無論在血清還是肺泡灌洗液，其 miR499 表達顯著增高（P＜0．01，圖 5）．

圖5 血清及肺泡灌洗液中miRNA499的相對表達圖

3 討論

目前，NSCLC，尤其是肺腺癌的分子標志物和靶向治療研究有了很多新的進展，但SCLC的分子標志物和靶向治療相關研究均未見新的報道．

miRNAs是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小為20～25個核苷酸．最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調節途徑，其中與腫瘤相關的調節是參與細胞增殖和凋亡［6－7］．miRNAs通過與其下游靶基因的 mRNA 的 3，UTR非翻譯區域相結合進行調節，具體作用方式取決于miRNAs與其靶基因mRNA匹配程度，近乎完全匹配抑制靶基因mRNA的轉錄，匹配程度較差抑制翻譯水平的蛋白表達．大約有30%的人類基因mR?NA受miRNAs的調控，在多種人類腫瘤組織中可檢測到 miRNAs的異常表達［8－10］，而 miRNA499 的高表達及基因的多態性也與肝癌［11］、喉癌［12］、口腔癌［13］和肺癌［14］密切相關．

在肺癌的發生發展過程中，miRNAs發揮著復雜的生物學功能，即可作為原癌基因促肺癌發生，亦可調節相關信號通路．研究顯示部分miRNAs對肺癌的相關癌基因進行調控，與肺癌的發生以及臨床預后有著密切關系．具體涉及與肺癌的轉移相關［15－16］，參與誘導肺癌的細胞凋亡過程［17］，與肺癌的早期診斷和病理分型相關［18－19］，與肺癌細胞對化療藥物的敏感性相關［20］，以及作為評估預后的價值［21］等．Meta 分析顯示miRNA499可能是肺癌的潛在生物標志物［14］，但具體與SCLC的關系尚未見明確的報道．

本研究對非肺癌呼吸疾病患者血清及肺癌患者血清及肺泡灌洗液中RNA濃度測定，發現總RNA的變化有著顯著變化．雖然這一檢測結果未必和miR?NA499有著直接關系．但是在研究肺癌患者體液中miRNA的表達變化時，應當給予重視，為什么患者血清中RNA的提取總量升高，有待進一步研究．或許預示著更多其他非miRNA499的 miRNAs、環狀 RNA、非編碼RNA的增加，目前我們尚不清楚其背后機制．在檢測RT逆轉錄后，對照組與SCLC患者血清及肺泡灌洗液中的cDNA進行qPCR檢測，結果顯示：SCLC患者血清和肺泡灌洗液中miRNA499的表達水平都明顯升高，差異有統計學意義（P＜0．05）．以這種差異表達情況為基礎，我們期待更進一步的研究，比如miRNA499可能作為癌基因參與SCLC患者腫瘤細胞的生長和轉移；miRNA499能否作為SCLC基因治療的一個靶點等．

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Expression of miRNA499 in serum and bron?choalveolar lavage fluid of patients with small cell lung cancer

ZHOU Feng?Li， FENG Ding?Yun， ZOU Xiao?Ling， WU Shao?Zhu， LIU Yan?Fei
Department of Respiratory Medicine， The Third Affiliated Hospi?tal， Sun Yat?sen University， Guangzhou 510630， China

AIM： To determine whether miRNA499 can be used as a molecular marker for early diagnosis of small cell lung cancer SCLC．METHODS： The serum and bronchoalveolar lavage fluid from 26 patients with SCLC and serum of 20 cancer?free controls with respiratory disease were collected．The RNA concentration and the cDNA concentration after reverse transcription were detec?ted．The expression of miRNA499 in serum and bronchoalveolar lavage fluid of patients with SCLC were also detected．RE?SULTS：①The expression levels of miRNA499 in serum and bronchoalveolar lavage fluid of patients with SCLC were signifi?cantly increased．②The miRNA499 gene was almost not expressed or not expressed in small cell lung cancer?free controls with respir?atory disease．CONCLUSION： The miRNA499 may be used as the early diagnosis index and the target of gene therapy for SCLC．

lung neoplasms； miRNA499； molecular markers

R734．2

A

2095?6894（2017）09?39?03

2017－05－04；接受日期：2017－05－20

廣東省科技計劃項目（2014A020212531）

周鳳麗．博士，副主任醫師，碩導．E?mail：zhoufenglizfl＠126．com