支氣管哮喘患者eotaxin-3基因多態性對吸入糖皮質激素的影響*

熊曉琦，宋新宇，曾凡軍，孟麗霞，阮玉姝，李文新

(三峽大學第一臨床醫學院/湖北省宜昌市中心醫院呼吸內科 443003)

支氣管哮喘患者eotaxin-3基因多態性對吸入糖皮質激素的影響*

熊曉琦，宋新宇△，曾凡軍，孟麗霞，阮玉姝，李文新

(三峽大學第一臨床醫學院/湖北省宜昌市中心醫院呼吸內科 443003)

目的探討eotaxin-3單核苷酸多態性(SNP)對吸入糖皮質激素(ICS)治療效果的影響，為eotaxin-3作為支氣管哮喘治療靶點提供臨床依據。方法收集哮喘患者(n=196)及對照者(n=196)的外周血標本，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法檢測eotaxin-3 +2497T>G ，+77C>T各種基因型，比較各種基因型的哮喘患者對ICS治療的反應性和ACT評分的變化情況。結果哮喘患者為+2497位TG基因型時，外周血嗜酸性粒細胞(EOS)計數、誘導痰EOS比例和外周血總IgE與TT型相比均明顯下降，且差異有統計學意義(P<0.05)，TG型哮喘患者的第1秒用力呼氣容積下降20%所需的最低累積劑量(PD20)水平[(0.07±0.03)mg]明顯高于TT型[(0.03±0.01)mg]，差異具有統計學意義(t=2.45，P=0.048)；而上述指標在+77位3種基因型間的差異均無統計學意義。+2497位TT型哮喘患者在ICS治療過程中，第1秒用力呼氣量、PD20值和ACT評分均較TG型哮喘患者明顯改善，差異具有統計學意義(P<0.01)。結論+2497位TT型哮喘患者對ICS治療更敏感，規律ICS治療能顯著改善該類患者的肺功能和臨床癥狀評分。

哮喘；eotaxin-3；單核苷酸多態性；吸入糖皮質激素

支氣管哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。目前認為嗜酸性粒細胞(EOS)是哮喘氣道炎癥發生的主要效應細胞[1]。EOS趨化因子eotaxin因對EOS有很強的選擇趨化性而得名，eotaxin只與CC趨化因子受體3(CC chemokine receptor3,CCR3)特異性地結合，eotaxin釋放后通過作用于EOS上高表達的CCR3受體，不僅能誘導EOS向肺內遷移， 而且也能活化EOS使之脫顆粒釋放活性物質，對氣道和肺組織造成損傷[2]。

近年來有研究表明，不是所有的哮喘患者氣道局部都是以EOS為主的慢性炎癥，臨床上發現部分哮喘患者對吸入糖皮質激素(ICS)的治療效果欠佳，而氣道以EOS浸潤為主的哮喘患者對激素治療反應更好[3]。目前有研究發現eotaxin的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與EOS的募集和血漿總IgE 水平有關[4]，因此eotaxin基因多態性可能通過影響哮喘患者氣道局部EOS的聚集從而影響其對ICS的敏感性。因此，本課題擬檢測與EOS的募集、維持更為密切的eotaxin-3的SNP(2497T>G,77C>T)，并觀察eotaxin-3+2497T>G，+77C>T不同基因型的支氣管哮喘患者對ICS治療的反應性和臨床癥狀改善情況，為eotaxin-3作為哮喘治療靶點提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月至2015年12月在本院就診的196例哮喘患者作為哮喘組，其中男92例，女104例，平均(43.21±10.68)歲。196例健康體檢者作為對照組，其中男90例，女106例，平均年齡(45.32±13.35)歲。

表1 PCR-RFLP各項參數設定

1.2入組及排除標準 年齡18～60歲，符合GINA診斷標準的患者為哮喘組，排除有吸煙史、糖皮質激素治療史、肺部有實質性病變及近4周有上呼吸道感染病史者。無明顯呼吸系統疾病者作為對照組，所有入組患者均簽署知情同意書。

1.3標本的采集及肺功能測試 采集血漿及誘導氮，受試者進行肺功能檢測后，當第1秒用力呼氣量(FEV1)/肺活量(FVC)為50%～80%時，給予支氣管激動劑乙酰甲膽堿吸入(累計最大劑量2.505 mg)，2 min后重復進行肺功能檢測，當FEV1下降20%時，記錄乙酰甲膽堿的用量，即第1秒用力呼氣容積下降20%所需的最低累積劑量(PD20)值。

1.4方法 利用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法檢測eotaxin-3基因SNP：(1)用苯酚-氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA。(2)合成eotaxin-3基因+2497位及+77位引物，PCR擴增目的基因片段，PCR產物經內切酶Eco105Ⅰ酶切(表1)。(3)酶切產物經4%瓊脂糖凝膠電泳分離，全自動數碼凝膠成像儀掃描分析結果。采用全自動血細胞計數儀測量EOS，用化學發光法測定IgE，儀器為瑞士羅氏 Cobas 601 全自動化學發光分析儀，均由本院檢驗科完成。

1.5臨床癥狀評估 所有哮喘患者在初診、ICS(布地奈德)治療第4周和第8周3個階段共進行3次ACT問卷評分。

2 結 果

2.1eotaxin-3 +2497位哮喘患者TT、TG基因型的臨床特征 經χ2檢驗，eotaxin-3 +2497和+77在對照組和哮喘組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。+2497位TT型和TG型哮喘患者在年齡、性別、體質量指數、發病年齡和病程方面比較均無明顯差異，肺功能方面TG型哮喘患者的PD20水平[(0.07±0.03)mg]明顯高于TT型[(0.03±0.01)mg]，差異具有統計學意義(t=2.45，P=0.048)，而兩組FEV1%預計值比較無明顯差異(表2，圖1)。哮喘患者為+2497位TG基因型時，外周血EOS計數、誘導痰EOS比例和外周血總IgE與TT型相比均明顯下降，且差異有統計學意義(P<0.05)，見表2，圖2。

表2 eotaxin-3 +2497T>G各種基因型哮喘患者的臨床特征

續表2 eotaxin-3 +2497T>G各種基因型哮喘患者的臨床特征

圖1 eotaxin-3+2497位TT型和TG型與對照組的FEV1%預計值比較

圖2 eotaxin-3 +2497位TT型和TG型哮喘患者誘導痰中EOS%比較

2.2eotaxin-3+2497位TT型和TG型支氣管哮喘患者對ICS治療的反應性 經過4周和8周的吸入布地奈德治療后，TT型哮喘患者FEV1[ΔFEV1第4周=(0.37±0.13)L；ΔFEV1第8周=(0.35±0.11)L]和PD20值的增加量[ΔPD20第4周=[(0.58±0.22)mg；ΔPD20第8周=(0.53±0.18)mg]明顯升高，而TG型哮喘患者在治療第4周和第8周時，FEV1[ΔFEV1第4周=(0.13±0.03)L；ΔFEV1第8周=(0.11±0.07)L]和PD20值的變化[ΔPD20第4周=[(0.04±0.02)mg；ΔPD20第8周=(0.03±0.01)mg]均不顯著，且兩組間的差異有統計學意義(均P<0.01)，見表3、圖3。

表3 eotaxin-3 +2497位TT型和TG型支氣管哮喘患者ICS治療后肺功能改善情況

A:FEV1；B：PB20；**：P<0.01， 與TG型比較

圖3 eotaxin-3+2497位TT型和TG型支氣管哮喘患者ICS治療第4周和8周FEV1和PD20的變化

2.3eotaxin-3 +2497位TT型和TG型支氣管哮喘患者治療前后臨床癥狀的評估 TT型哮喘患者在布地奈德吸入治療第4周、8周臨床癥狀(包括喘息、呼吸困難和夜間發作次數)得到明顯改善，ACT評分較TG型哮喘患者明顯改善，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

**：P<0.05，與TG型比較

圖4 eotaxin-3 +2497位TT型和TG型哮喘患者ICS治療第4周和8周ACT評分的變化

3 討 論

eotaxin 在支氣管哮喘的發病過程中起著重要作用，其影響EOS的黏附、募集和脫顆粒，血清中eotaxin的表達水平與哮喘的急性發作及臨床癥狀嚴重程度相關[5]。eotaxin-3屬于eotaxin基因家族亞家族成員之一，此外還包括：eotaxin-l和eotaxin-2，而人類eotaxin-3成熟體由77個氨基酸構成，eotaxin-3是一種與eotaxin-1、eotaxin-2結構不同，但功能相似的EOS趨化因子，在體外eotaxin-3對EOS具有趨化作用及引起細胞內Ca2+濃度快速、短暫升高。之前已有文獻報道哮喘患者支氣管黏膜eotaxin-3 mRNA表達是明顯增高的[6]。近年來國內外已研究的哮喘患者eotaxin SNP有eotaxin-1：67G>A，1820A>C，1834T>G，1384G>A，576C>T， 384A>G，426C>T；eotaxin-2： 96G>A，179T>C ，275C>T，304A>C，1923C>A，1926G>A；eotaxin-3：77C>T，2497T>G等位點[7]。eotaxin-3位于7q11.23染色體上，共有3個外顯子，目前已經發現有7個SNP位點，其中有5個位于內含子區域，一個位于5′-非編碼區，另一個位于3′-非編碼區[8]。本文研究的eotaxin-3 +2497和+77分別位于3′-非編碼區和內含子區域。

之前國內有研究發現，eotaxin-3 +2497T>G多態性與哮喘易感性、外周血EOS數量、IgE水平相關，+77C>T基因多態性與哮喘患者外周血EOS數量有關。而Chae等[9]在對eotaxin基因家族基因多態性與哮喘關系的研究中發現eotaxin-3 +2497位點可能在EOS的募集和血漿總IgE水平的維持中起重要作用。這與本文筆者對eotaxin-3 +2497T>G多態性的研究結果一致，而+77C>T基因多態性筆者并未發現與上述指標的相關性。外周血總IgE水平能用于評估哮喘患者的過敏狀態，eotaxin-3 +2497位TT型哮喘患者外周血總IgE水平明顯高于TG型哮喘患者，說明TT型哮喘患者對過敏原的敏感性高，更容易致敏。

在此基礎上為了進一步探索eotaxin-3不同基因型支氣管哮喘患者對ICS治療的反應性，筆者對eotaxin-3 +2497位的TG型和TT型支氣管哮喘患者進行了吸入糖皮質激素反應試驗比較，通過檢測兩種基因型支氣管哮喘患者在吸入布地奈德治療8周過程中肺功能指標FEV1和PD20值的變化情況，探討支氣管哮喘eotaxin-3 +2497位TT型和TG型與ICS治療的不同反應性之間的關系。本研究結果發現TT型哮喘患者在ICS治療后，肺功能FEV1和PD20值的增加量(ΔFEV1和ΔPD20)明顯升高，肺功能得到改善，而TG型哮喘患者的ΔFEV1和ΔPD20值并無明顯改善。這表明eotaxin-3 +2497位TT型哮喘患者對ICS治療的反應性更敏感，而這可能與TT型哮喘患者更易引起EOS聚集從而導致氣道以EOS浸潤為主有關，因此規律的ICS治療能顯著降低TT型哮喘患者的氣道高反應性，改善肺功能。

同時筆者還對兩種基因型哮喘患者治療前后臨床癥狀進行了評估，發現TT型哮喘患者在布地奈德吸入治療第4周、8周ACT評分較TG型哮喘患者明顯改善，這部分患者的臨床癥狀改善情況與其肺功能改善情況一致，從而進一步證實eotaxin-3 +2497位TT型哮喘患者進行規律的ICS治療能控制其哮喘發作頻率和改善肺功能。

綜上所述，本研究證實，eotaxin-3 +2497 TT型哮喘患者的發病基礎可能與外周血EOS的增多和氣道EOS局部浸潤有關，此型哮喘患者對ICS的治療更敏感，規律的ICS治療能顯著降低此型哮喘患者氣道高反應性，改善肺功能和臨床癥狀。

[1]Ahmadi Z,Hassanshahi G,Khorramdelazad H,et al.An overlook to the characteristics and roles played by eotaxin network in the pathophysiology of food allergies:allergic asthma and atopic dermatitis[J].Inflammation,2016,39(3):1253-1267.

[2]Borish L.The immunology of asthma:asthma phenotypes and their implications for personalized treatment[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2016,117(2):108-114.

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Impactofeotaxin-3genepolymorphismsoninhaledcorticosteroidsinpatientswithbronchialasthma*

XiongXiaoqi,SongXinyu△,ZengFanjun,MengLixia,RanYushu,LiWenxin

(DepartmentofRespiration,FirstClinicalCollegeofThreeGorgesUniversity/YichangMunicipalCentralPeople′sHospital,Yichang,Hubei443003,China)

ObjectiveTo investigate the impact of eotaxin-3 gene polymorphisms on the clinical effect of inhaled corticosteroids (ICS) to provide clinical basis for eotaxin-3 as the target spot for treating bronchial asthma.MethodsOne hundred and ninety-six cases of asthma and 196 cases as controls were selected from the outpatients and inpatients in our hospital.Peripheral blood samples were collected from the asthma patients and normal controls.PCR-RFLP was adopted to detect the genotypes of eotaxin-3 +2497T>G and +77C>T.The response of ICS treatment and the change situation of ACT scores were compared among asthmatic patients with various genotypes.ResultsPeripheral blood eosinophil(EOS) counts,EOS proportion and total IgE in the patients with TG genotype at+2497 locus were significantly decreased compared with those in the patients with TT genotype,the difference was statistically significant(P<0.05).The level of PD20 in asthmatic patients with TG genotype was significantly higher than that in the patients with TT genotype,the difference was statistically significant[(0.07±0.03)mgvs. (0.03±0.01)mg,t=2.45，P=0.048];whereas the above indicators had no statistical difference among 3 kinds of +77 genotypes.During ICS treatment process in the patients with TT genotype at +2497 locus,the FEV1%,PD20 value and ACT scores were significantly improved compared with those in the patients with TG genotype,the difference was statistically significant(P<0.01).ConclusionThe asthmatic patients with TT genotype at +2497 locus were more sensitive to ICS treatment,regular ICS treatment can significantly improve the lung function and clinical symptom score in these patients.

asthma；eotaxin-3；single nucleotide polymorphism；inhaled corticosteroids

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.013

R256.12

A

1671-8348(2017)27-3786-03

2016-11-06

2017-05-24)

湖北省教育廳科研計劃項目(B2015254)。

熊曉琦(1975-)，碩士，副主任醫師，主要從事慢性氣道疾病、肺癌方面的研究。△

，E-mail:songxinyuhxk@126.com。