腹腔注射氫氣與富氫生理鹽水對新生大鼠高氧肺損傷的作用研究

吳 丹，姚 蘭，于 攀，孫學軍，方 芳，許 峰，劉成軍

(1.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院PICU，重慶 400014；2.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸二病房/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014；3.南京大學醫(yī)學院金陵醫(yī)院燒傷整形科，南京 210002；4.第二軍醫(yī)大學海軍醫(yī)學系潛水醫(yī)學部，上海 200433)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.004

腹腔注射氫氣與富氫生理鹽水對新生大鼠高氧肺損傷的作用研究

吳 丹1，姚 蘭2△，于 攀3，孫學軍4，方 芳1，許 峰1，劉成軍1

(1.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院PICU，重慶 400014；2.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸二病房/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400014；3.南京大學醫(yī)學院金陵醫(yī)院燒傷整形科，南京 210002；4.第二軍醫(yī)大學海軍醫(yī)學系潛水醫(yī)學部，上海 200433)

目的對比分析腹腔注射氫氣(H2)和富氫生理鹽水對高氧致新生大鼠肺損傷的作用。方法將SD新生大鼠分為6組(每組10只)，A組(空氣組)、B組(空氣+富氫生理鹽水組)、C組(空氣+H2組)、D組(高氧組)、E組(高氧+富氫生理鹽水組)、F組(高氧+H2組)。A、B、C組置于空氣中，D、E、F組置于95% O2中，B、E組每日腹腔注射富氫生理鹽水2次(10 mL/kg)，C、F組每日腹腔注射H22次(10 mL/kg)，A、D組每日腹腔注射普通生理鹽水2次(10 mL/kg)。于實驗第15天收集肺組織和血清標本，蘇木精-伊紅(HE) 染色后光鏡下觀察肺組織病理改變和輻射狀肺泡計數(shù)(RAC)，堿水解法檢測肺組織羥脯氨酸(HYP)、血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平，免疫組織化學SP法檢測肌成纖維細胞表型標志α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達。結(jié)果與A組相比，D組RAC、血清SOD活力明顯降低，HYP、MDA水平及α-SMA表達均明顯增加，H2干預可顯著緩解高氧所致上述變化，腹腔注射H2較腹腔注射富氫生理鹽水效果更佳。結(jié)論H2可一定程度減輕高氧導致的肺氧化損傷、發(fā)育受阻及纖維化指標，腹腔注射H2較腹腔注射高氫生理鹽水效果更佳。

氫；肺纖維化；高氧肺損傷；肺發(fā)育

氧療是重要的臨床治療手段，但持續(xù)高濃度的用氧會導致肺損傷，以前期炎性反應及后期肺纖維化為主要表現(xiàn)，在新生兒特別是早產(chǎn)兒還可影響肺發(fā)育，導致支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的發(fā)生，嚴重影響患兒健康。已有大量研究報道了氫氣(H2)作為抗氧化劑，在氧化應激相關的多種疾病中發(fā)揮保護作用[1]。也有研究報道小劑量H2可減輕高氧導致的成年鼠肺損傷[2]，在脂多糖(lipopolysaccaride,LPS)誘導的新生鼠BPD模型中也觀察到了H2的保護效應[3]。H2較高的生物安全性及良好的生物膜通透性、組織相容性等優(yōu)點決定其可能成為BPD防治的新選擇。本文以高氧誘導的BPD模型為研究對象，觀察H2對高氧導致的新生鼠肺損傷的干預作用，并對比分析腹腔注射富氫生理鹽水及直接注射H2的效應差異，為BPD的防治尋求新方法，為H2在BPD的應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD臨產(chǎn)孕鼠，購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心。

1.2試劑 富氫生理鹽水、H2(重慶朝陽氣體公司)；丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)；SP和DAB顯色試劑盒、羥脯氨酸(HYP)檢測試劑盒。

1.3方法

1.3.1富氫生理鹽水的制備 按照第二軍醫(yī)大學孫學軍等[2]的方法制作：即在0.4 Mpa壓力下加壓暴露6 h，將純H2充分溶解于生理鹽水中，制作過程無菌操作，生理鹽水中溶解的H2濃度達到0.6 mmol/L。

1.3.2實驗分組 待SD臨產(chǎn)孕鼠自然分娩，將新生大鼠分為6組(每組10只)，A組(空氣組)、B組(空氣+富氫生理鹽水組)、C組(空氣+H2組)、D組(高氧組)、E組(高氧+富氫生理鹽水組)和F組(高氧+H2組)。D、E、F組大鼠均置于氧氣(O2)體積分數(shù)為95%的動物氧艙中。H2干預：富氫生理鹽水組大鼠腹腔注射富氫生理鹽水10 mL/kg，每天2次；H2組大鼠予腹腔注射H2氣體10 mL/kg，每天2次。A、D組大鼠則腹腔注射等量生理鹽水。室溫維持在24～25 ℃,自由進食和水,每日9：00開箱，稱體質(zhì)量，進行清掃，對換高氧組與空氣組母鼠防止其氧中毒，開箱時間不超過1 h。

1.3.3肺組織和血清標本的收集 于實驗第15天，每組各取6只大鼠肺組織和血清標本用于檢測，腹腔注射10%水合氯醛(10 μL/g)麻醉后，右肺組織取出置入液氮中速凍后，于-80 ℃保存，用于后續(xù)分子生物學實驗，左肺用4%多聚甲醛固定,4 ℃過夜，次日制成5 μm石蠟組織切片；采用心臟取血法取血后將血液緩慢注入消毒后的1.5 mL EP管離心，取上層血清分裝，-20 ℃保存。

1.3.4肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色 將制成的石蠟組織切片進行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變的同時隨機取5個不重疊的視野(200×)進行輻射狀肺泡計數(shù)(RAC)，RAC的測定參照文獻[3]，計數(shù)從呼吸性細支氣管中心至最近纖維隔或胸膜的垂線上的肺泡數(shù)。

1.3.5MDA和SOD的檢測 黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色。按照試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測550、532 nm處吸光度值，根據(jù)公式分別計算SOD活力和MDA水平。

1.3.6HYP水平 實驗步驟按說明書進行，根據(jù)HYP在氧化劑作用下產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色，酶標儀測定550 nm處吸光度值，根據(jù)公式計算HYP水平。

1.3.7α-SMA表達 采用免疫組織化學SP法，DAB顯色，利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色，對目的蛋白進行定性、定位研究。使用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)采集圖像，將肺組織各切片隨機取染色區(qū)域6個高倍視野(×400)，測量并記錄每個視野陽性染色的平均積分吸光度(IA)。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學改變 HE染色顯示A、B、C組新生鼠肺泡多且小，肺泡間隔均一，排列規(guī)整。而D組肺泡融合，肺泡間隔顯著增厚，肺泡數(shù)量較A、B、C組明顯減少，大小不等，纖維細胞增生顯著。高氧加富氫生理鹽水和H2干預后上述病理變化均有所減輕，見圖1。

A：A組；B：D組；C：E組；D：F組

圖1大鼠肺組織典型病理學改變(HE×100)

2.2RAC值 A、B、C組RAC值無明顯差異，D組RAC值較A組顯著降低，E、F組RAC值較D組有所增高，但仍低于A組，差異有統(tǒng)計學意義，E、F組間RAC值無明顯差異，見圖2。

#：P<0.05，與A組比較；&：P<0.05，與D組比較

圖2各組大鼠RAC比較

2.3血清MDA水平和SOD活力 A、B、C組大鼠血清MDA水平、SOD活力無顯著差異，D組血清MDA水平較A組明顯增高、SOD活力較A組明顯降低，E、F組血清中MDA水平較D組均明顯降低、SOD活力較高D組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。F組較E組MDA水平略低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)組SOD活力較E組略高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

#：P<0.05，與A組比較；&:P<0.05，與D組比較；$:P<0.05，與E組比較

圖3高氧及氫氣干預對大鼠血清MDA水平和SOD活力的影響

2.4肺組織α-SMA表達 A、B、C組肺組織除大血管和氣道平滑肌有α-SMA表達外,肺細支氣管、肺泡表面和肺泡間隔均有少量α-SMA表達。D組較A組α-SMA表達明顯增多，在肺泡表面和肺泡間隔尤為明顯，E、F組α-SMA表達較D組明顯減少，E、F組間比較無明顯差異，見圖4。

A:A組；B:B組；C:E組；D:F組；#：P<0.05，與A組比較；&：P<0.05，與D組比較

圖4免疫組織化學法檢測各組大鼠肺組織α-SMA蛋白表達

2.5肺組織HYP水平 A、B、C組肺組織HYP水平無顯著差異。D組較A組肺組織HYP水平明顯升高(0.659±0.036vs.0.441±0.023)mg/g肺濕重，E、F組HYP水平較D組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)組較E組效果更好(0.509±0.038vs.0.563±0.021)mg/g肺濕重，差異有統(tǒng)計學意義，見圖5。

#：P<0.05，與A組比較；&：P<0.05，與D組比較；$：P<0.05，與E組比較

圖5各組大鼠肺組織HYP水平

3 討 論

BPD是多因素導致的復雜疾病，氧療是治療新生兒缺氧的常用手段，但持續(xù)高濃度氧療會導致肺損傷、肺發(fā)育受阻，是誘導BPD發(fā)生的主要原因之一。近年來新生兒醫(yī)學和圍生醫(yī)學的發(fā)展，使極低出生體質(zhì)量兒存活率增加，BPD的發(fā)生率隨之增加，而對此目前仍無有效治療手段，干細胞治療現(xiàn)也仍處于實驗階段[4]。近年來H2在多器官多系統(tǒng)的多種損傷模型中均觀察到了強大的保護效應[11-14]。Muramatsu等[15]發(fā)現(xiàn)H2可通過減少炎癥因子及毒性活性氧(ROS)的釋放減少新生大鼠BPD的發(fā)生，但其具體機制尚不完全清楚，抗氧化作用仍被認為是其主要機制之一[5]，而氧化應激與高氧誘導BPD關系密切，H2可能為BPD的防治帶來新突破，因此H2在高氧致BPD中的作用值得進一步研究。

本研究結(jié)果顯示高氧組MDA水平明顯增高、SOD活力明顯降低，氧化損傷明顯，抗氧化能力降低，肺組織α-SMA表達和HYP水平明顯增多，肺纖維化明顯。H2干預后，高氧所導致的上述變化均有明顯改善，H2在高氧所導致的肺組織氧化損傷、肺纖維化過程中均發(fā)揮了保護效應。結(jié)果與其他研究較為一致[6]。同時，研究結(jié)果也顯示H2能明顯減輕長時間使用高濃度氧導致的肺氧化損傷，改善肺發(fā)育受阻和肺纖維化，這對于改善BPD遠期預后有重要意義。

H2攝入途徑多樣，有直接吸入H2氣體、飲用富氫水、注射富氫生理鹽水、氫水浴等，而H2在各研究中的用量大相徑庭。既往研究發(fā)現(xiàn)只要給予小劑量H2即可達到治療效果，增加H2用量能否取得更好效果？Ohsawa等[7]研究發(fā)現(xiàn)吸入2%和4%H2在大鼠腦缺血再灌注損傷時大腦梗死面積無顯著差異。有研究對比分析腹腔注射生理鹽水和H2對大鼠或兔H2代謝的影響，發(fā)現(xiàn)等量腹腔注射H2也能快速提高機體H2濃度，并較腹腔注射富氫生理鹽水維持更長時間的H2高水平狀態(tài)[8-9]。且有研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射H2作為有效治療手段對心臟驟停兔的腦發(fā)揮保護效應[10]。為保證實驗安全性及H2用量的準確性，本研究采用腹腔注射富氫生理鹽水的方式，為進一步驗證H2的量效關系，本研究還采用了腹腔注射等體積H2，并對兩種方式進行了對比分析。結(jié)果顯示兩種方式均可明顯改善高氧所致新生大鼠肺損傷，而腹腔注射H2較腹腔注射富氫生理鹽水更為顯著地降低了MDA和HYP水平，提示其保護效應可能存在一定的量效關系，但需進一步研究。

綜上所述，H2對高氧致肺損傷過程中肺組織的氧化應激損傷、肺發(fā)育受阻及肺纖維化等過程均發(fā)揮了保護效應，腹腔注射等體積H2的H2攝入量遠大于腹腔注射富氫生理鹽水，在部分檢測指標中觀察到了更好的保護作用，提示其保護效應可能存在一定的量效關系。H2可能成為防治BPD的有效手段之一，而目前H2的研究多為動物實驗，其臨床效應有待進一步驗證，其用量、方式及具體作用機制有待更深入的研究。

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Effectofintraperitonealinjectionofhydrogenandhydrogen-richsalineinneonatalratswithhyperoxia-inducedlunginjury*

WuDan1，YaoLan2△，YuPan3，SunXuejun4，F(xiàn)angFang1，XuFeng1，LiuChengjun1

(1.PediatricIntensiveCareUnit,AffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China;2.SecondDepartmentofRespiration,AffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity/MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders,Chongqing400014,China;3.DepartmentofBurnandPlasticSurgery,JinlingHospital,SchoolofMedicine,NanjingUniversity,Nanjing,Jiangsu210002,China;4.DepartmentofDivingMedicine,FacultyofNavalMedicine,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

ObjectiveTo observe and comparatively analysize the effect of intraperitoneal injection of hydrogen and hydrogen-rich saline in neonatal rats with hyperoxia-induced lung injury.MethodsSprague-Dawley(SD) newborn rats were randomly divided into six groups(n=10).air group(A),air+ hydrogen-rich saline group(B),air+hydrogen group(C),hyperoxia group(D),hyperoxia+hydrogen-rich saline group (E) and hyperoxia+hydrogen group(F).The group A,B and C were exposed to air and group D,E and F were exposed to 95% oxygen.The group B and E were intraperitoneally injected with hydrogen-rich saline (10 mL/kg,twice daily),while the groups C and F with hydrogen (10 mL/kg,twice daily).The group A and D were injected with normal saline(10 mL/kg,twice daily).Lung tissue and serum samples were collected on 15 d of experiment.The pathological changes of lung tissue and radiate alveoli count (RAC) were observed by HE staining.The content of HYP in lung tissue was detected by the alkaline hydrolysis method,serum SOD and MDA levels were measured.The expression of α-SMA in lung tissue was detected by immunohistochemistry SP method.ResultsCompared with the A group,RAC and SOD activities in the D group were significantly decreased,while the HYP and MDA levels and α-SMA expression were significantly increased.Hydrogen intervention could significantly alleviate these changes caused by hyperoxia.while intraperitoneal injection of hydrogen got better effect than intraperitoneal injection of hydrogen-rich saline.ConclusionHydrogen can extenuate the indexes of hyperoxia-induced lung oxidative damage,impairment development and fibrosis to a certain extent.Intraperitoneal injection of hydrogen has slightly better effect than hydrogen-rich saline.

hydrogen;pulmonary fibrosis;hyperoxia-induced lung injury;pulmonary development

R729

A

1671-8348(2017)25-3466-04

2017-01-20

2017-06-08)

重慶市科委基金資助項目(cstc2013jcyjA10031)。

吳丹(1991-)，碩士，主要從事高氧肺損傷方面的研究。

△通信作者，E-mail:yaolankaoyan2008@163.com。