p,p′-DDE與雄激素受體突變體H874Y及T877A激動(dòng)性作用機(jī)制的理論研究

朱婧涵，薛嶠，劉嫻，張愛(ài)茜,*

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 1000852. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049

p,p′-DDE與雄激素受體突變體H874Y及T877A激動(dòng)性作用機(jī)制的理論研究

朱婧涵1,2，薛嶠1,2，劉嫻1,2，張愛(ài)茜1,2,*

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 1000852. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049

1,1-二氯-2,2-雙(對(duì)氯苯基)乙烯(p,p′-DDE)是一種已知的雄激素受體(androgen receptor, AR)拮抗劑。有趣的是，已有研究證實(shí)p,p′-DDE同時(shí)可經(jīng)由作用于AR的2種天然突變體H874Y和T877A產(chǎn)生擬雄激素效應(yīng)，但其相互作用的分子機(jī)制尚不清晰。本研究聯(lián)用分子動(dòng)力學(xué)模擬與MM-GBSA方法，以內(nèi)源性激素二氫睪酮(DHT)作為對(duì)照，對(duì)p,p′-DDE與2種突變體的相互作用分子機(jī)制進(jìn)行了研究。模擬結(jié)果指出范德華相互作用是維持p,p′-DDE與AR突變體結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力，而溶劑化作用的差異是導(dǎo)致p,p′-DDE與H874Y具有較高結(jié)合活性的主要原因，H874Y結(jié)合口袋與p,p′-DDE的結(jié)構(gòu)匹配度優(yōu)于與T877A。與內(nèi)源性配體二氫睪酮相比較，范德華作用與靜電相互作用的差異是造成p,p′-DDE比DHT結(jié)合活性低的主要原因，p,p′-DDE與AR突變體之間缺乏氫鍵的穩(wěn)定。MM-GBSA的結(jié)果確定p,p′-DDE與突變體結(jié)合過(guò)程的關(guān)鍵氨基酸以疏水性殘基為主，其中L704、M745、L873尤為重要。計(jì)算獲得的p,p′-DDE對(duì)H874Y及T877A相互作用分子機(jī)制有助于理解該污染物在不同人群中內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的差異。

p,p′-DDE；雄激素受體突變體H874Y；雄激素受體突變體T877A；分子動(dòng)力學(xué)；MM-GBSA

Received14January2017accepted8March2017

Abstract:1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene (p,p′-DDE) as a typical androgen receptor (AR) antagonist exhibits agonism effect on AR mutants H874Y or T877A. The structural basis for agonism mechanisms of p,p′-DDE via H874Y/T877A is still unclear. Thus, molecular dynamics (MD) simulations combined with MM-GBSA was used to perform computational calculations for exploring the interaction features of p,p′-DDE-AR mutant complex. The result is consistent with the reported experiment. The Van der Waals interaction is found to be the predominant driving force facilitating the complex stability. Compared with T877A, H874Y presents a higher binding activity with p,p'-DDE due to its favorable solvation effect, and its binding pocket fits p,p′-DDE better than T877A. In comparison with the endogenous ligand dihydrotestosterone, p,p'-DDE shows lower mutant binding affinity because of decreased van der Waals energy and electrostatic energy. The lack of hydrogen bonds between p,p′-DDE and AR-mutants destabilizes the interaction between p,p'-DDE and AR mutants. Moreover, the result of MM-GBSA identifies the key residues between p,p'-DDE and AR mutants. Nonpolar residues in the binding pocket, especially L704, M745and L873, play important roles in the binding process. The obtained molecular mechanism for the interaction between p,p′-DDE and the AR mutants provides insight to the cohort effect observed for the health hazard of the pollutant.

Keywords: p,p′-DDE; AR mutant H874Y; AR mutant T877A; molecular dynamics simulation; MM-GBSA

雄激素受體(androgen receptor, AR)是核受體超家族成員之一[1]，可與內(nèi)源性雄激素雙氫睪酮(dihydrotestosterone, DHT)結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核中，結(jié)合靶基因上的雄激素受體反應(yīng)元件，在招募不同類型的共調(diào)節(jié)因子后發(fā)揮其調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的功能[2]。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌(prostate cancer, PCa)細(xì)胞中AR編碼區(qū)存在許多天然突變體，而其配體結(jié)合域(ligand binding domain, LBD)是突變發(fā)生頻率最大的區(qū)域[3-4]。T877A和H874Y均是AR-LBD中較為常見(jiàn)的突變。T877A突變發(fā)生于LNCaP細(xì)胞和CRPC組織樣本[5]，它位于AR-LBD的H11上并處在結(jié)合口袋之中[6]，其突變能夠影響AR與雄激素、非雄激素性類固醇(如雌激素和孕激素)和雄激素拮抗劑等多種化合物的調(diào)控效應(yīng)[5]。H874Y突變主要存在于22Rv1細(xì)胞系中，它同樣位于H11上，但遠(yuǎn)離配體結(jié)合口袋[1]，研究表明它能夠間接影響AR的配體和共激活因子結(jié)合的特異性[7]。這2種突變均能夠擴(kuò)大AR配體特異性的范圍[8-9]，使得AR變得異常活化而產(chǎn)生功能性紊亂[10-11]。

1,1-二氯-2,2-雙(對(duì)氯苯基)乙烯(1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene, p,p′-DDE)是1,1,1-三氯-2,2-雙(對(duì)氯苯基)乙烷(1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane, DDT)最主要的代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。p,p′-DDE是一種典型的具有穩(wěn)定化學(xué)性質(zhì)、較強(qiáng)親脂性以及抗新陳代謝性的持久性有機(jī)污染物，它能夠通過(guò)食物鏈逐漸在動(dòng)物和人體組織中長(zhǎng)時(shí)間累積[12-13]。有數(shù)據(jù)顯示，p,p′-DDE在人體血漿中的半存留期長(zhǎng)達(dá)10年[14]。作為一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，p,p′-DDE具有較強(qiáng)的抗雄激素效應(yīng)[15]，當(dāng)其進(jìn)入人體后，會(huì)與AR的LBD直接結(jié)合，阻斷AR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路并抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已有研究表明p,p′-DDE能夠引起嬰幼兒神經(jīng)發(fā)育障礙[16-17]，增大人體患乳腺癌[18]、前列腺癌[19]、糖尿病[20]和病態(tài)妊娠的風(fēng)險(xiǎn)[21]。

圖1 p,p′-DDE(左)和二氫睪酮(右)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of p,p′-DDE (left) and dihydrotestosterone (DHT) (right)

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AR的His874和Thr877分別突變成Tyr874和Ala877時(shí)，p,p′-DDE的抗雄激素效應(yīng)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閿M雄激素激動(dòng)效應(yīng)，介導(dǎo)H874Y/T877A突變體發(fā)生異常的雄激素非依賴性激活，在雄激素去勢(shì)的情況下刺激PCa細(xì)胞的增殖，促進(jìn)異種腫瘤的生長(zhǎng)。而熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DHT是突變體H874Y和T877A的強(qiáng)激動(dòng)劑，以DHT作為AR激動(dòng)活性的陽(yáng)性對(duì)照，p,p′-DDE與H874Y/T877A的活性分別為DHT的36.5%和9.9%，均遠(yuǎn)低于DHT[22]。可見(jiàn)，p,p′-DDE是這2個(gè)AR突變體的弱激動(dòng)劑。但目前對(duì)于p,p′-DDE這種奇特的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)還缺乏分子層次的認(rèn)知，尤其是p,p′-DDE對(duì)H874Y及T877A的激動(dòng)性干擾效應(yīng)是更值得關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明相比于T877A，H874Y對(duì)p,p′-DDE具有更高的親和性，但對(duì)于其親和性的差異也缺乏研究。目前關(guān)于p,p′-DDE與AR及突變體的研究大多還集中于其生物效應(yīng)層面，缺乏結(jié)構(gòu)方面的信息，這嚴(yán)重制約了全面認(rèn)知p,p′-DDE對(duì)AR的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。

為了從結(jié)構(gòu)層面解析p,p′-DDE與H874Y及T877A相互作用的分子基礎(chǔ)，本研究采用分子動(dòng)力學(xué)(molecular dynamics, MD)模擬的方法，分別對(duì)p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A復(fù)合物進(jìn)行了研究，用以探索p,p′-DDE與2種突變體的激動(dòng)性結(jié)合機(jī)制。為了更明晰這種激動(dòng)性效應(yīng)的分子基礎(chǔ)，我們還對(duì)內(nèi)源性配體DHT與H874Y及T877A的復(fù)合物也進(jìn)行了長(zhǎng)程的MD模擬用以對(duì)照。4個(gè)復(fù)合物體系分別進(jìn)行了80 ns時(shí)長(zhǎng)的MD模擬，采用多種結(jié)構(gòu)分析并使用MM-GBSA的方法計(jì)算了各體系受體配體之間的結(jié)合自由能與單個(gè)氨基酸的能量貢獻(xiàn)。該結(jié)果將有助于在原子層面探索p,p′-DDE與AR突變體產(chǎn)生激動(dòng)效應(yīng)的分子機(jī)制，對(duì)全面理解p,p′-DDE與AR的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。

1 模擬方法(Methods)

1.1 理論模型的建立

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank, PDB)中缺少p,p′-DDE與H874Y和T877A的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，必須使用理論方法構(gòu)建其復(fù)合物結(jié)構(gòu)。因此，實(shí)驗(yàn)采用Sybyl-X 1.2軟件包中Surflex-Dock模塊進(jìn)行分子對(duì)接，其中H874Y和T877A均采用了PDB中的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID 分別為2Q7K和2OZ7)，以此來(lái)保證受體蛋白模板的可信性。在對(duì)接前對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析與前處理，補(bǔ)全蛋白質(zhì)缺失殘基并確定了相關(guān)氨基酸殘基的質(zhì)子態(tài)。采用Powell方法計(jì)算能量?jī)?yōu)化構(gòu)象，Gasteiger Hückel方法計(jì)算原子電荷，Tripos標(biāo)準(zhǔn)分子力場(chǎng)進(jìn)行優(yōu)化，能量收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.005 kcal·(mol·?)-1，最大迭代次數(shù)為1 000，最終以打分最高的對(duì)接構(gòu)象為基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)分子力學(xué)的優(yōu)化，構(gòu)建p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A這2種復(fù)合物結(jié)構(gòu)。從PDB中獲得DHT與AR野生型復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 1T7T)，使用Sybyl-X 1.2分別對(duì)其進(jìn)行H874和T877單點(diǎn)氨基酸突變，獲得DHT-H874Y和DHT-T877A的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。為了驗(yàn)證對(duì)接方法的可靠性及對(duì)接參數(shù)的合理性，在構(gòu)建復(fù)合物結(jié)構(gòu)之前，將晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 2Q7K、2O7Z)中共結(jié)晶的配體小分子提取出來(lái)，重新將其對(duì)接至活性口袋，并將所得到的配體最優(yōu)構(gòu)象與其共結(jié)晶構(gòu)象等進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示對(duì)接獲得的配體2Q7K與2O7Z空間取向和結(jié)合模式與結(jié)晶構(gòu)象完全一致，其均方根偏差分別僅為0.15和0.72 ?(圖2)，表明所采用的對(duì)接手段能夠再現(xiàn)共結(jié)晶配體同受體蛋白的結(jié)合模式，生成的原型復(fù)合物適合用于作為后續(xù)分子動(dòng)力學(xué)模擬的起始結(jié)構(gòu)。

1.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

在模擬過(guò)程中，受體蛋白的拓?fù)鋮?shù)均采用AMBER12中的ff12SB力場(chǎng)構(gòu)建。配體的原子點(diǎn)電荷計(jì)算采用AMBER12 antechamber程序AM1-BCC電荷模型，力場(chǎng)參數(shù)使用General AMBER Force Field (GAFF)生成[23]。使用Amber12程序包中LEaP模塊添加體系中缺失的氫原子，并向體系中添加相應(yīng)的Cl-離子以保持體系的電中性。在模擬過(guò)程中采用周期邊界條件，溶劑模型為TIP3P水模型，從水盒子的任意邊界到復(fù)合物任意原子之間的距離至少8 ?。

AMBER12 PMEMD程序用于能量最小化、加熱和體系的平衡。首先，對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行能量最小化。第一步最小化過(guò)程以10 kcal·mol-1·?-2的約束力常數(shù)約束溶質(zhì)，對(duì)體系進(jìn)行1 000步的最陡下降法和1 000步的共軛梯度法來(lái)先后優(yōu)化體系中的溶劑環(huán)境；第二步最小化過(guò)程以2 000步最陡下降法和3 000步共軛梯度法來(lái)先后對(duì)體系進(jìn)行全原子優(yōu)化，以去除整個(gè)體系中能量不正常的相互作用。每一步的最小化過(guò)程中非鍵截?cái)喟霃骄鶠?0 ?。

優(yōu)化之后的復(fù)合物結(jié)構(gòu)采用Langevin動(dòng)力學(xué)方法[24]使體系在300 ps內(nèi)由0 K升溫至300 K，碰撞頻率為1 ps-1，約束力常數(shù)為10 kcal·mol-1·?-2。隨后在正則系綜(NVT)條件下進(jìn)行了50 ps時(shí)長(zhǎng)的MD模擬對(duì)體系進(jìn)行平衡。最后在等溫等壓(NPT, P=1 atm, T=300 K)條件下分別對(duì)4個(gè)復(fù)合物體系進(jìn)行了80 ns的長(zhǎng)程動(dòng)力學(xué)模擬。在模擬中，采用PME方法計(jì)算長(zhǎng)程靜電相互作用[25]，所有含氫原子的鍵的伸縮均使用SHAKE算法進(jìn)行約束[26]，整個(gè)體系的非鍵截?cái)喟霃綖?0 ?，時(shí)間步長(zhǎng)設(shè)置為2 fs[27-28]，每2 ps保存一幀構(gòu)象。

1.3 MM-GBSA自由能計(jì)算

為了從能量層面探究p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A、DHT-H874Y和DHT-T877A這4個(gè)復(fù)合物體系中配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)采用MM-GBSA方法計(jì)算蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物之間的結(jié)合自由能。結(jié)合自由能的計(jì)算原理如下：

ΔGbind=Gcomplex-(Gprotein+Gligand)

(1)

Gbind=Emm+Gsolv-TS

(2)

Emm=Einternal+Eelectrostatic+EvdW

(3)

Gsolv=GGB+GSA

(4)

GSA=γSASA+b

(5)

Gcomplex、Gprotein和Gligand分別為復(fù)合物、蛋白質(zhì)和配體的自由能。Emm和Gsolv代表分子力學(xué)自由能及溶劑化自由能。TS為結(jié)合構(gòu)象熵，包括溶質(zhì)分子在構(gòu)象上的平移、轉(zhuǎn)動(dòng)以及振動(dòng)[29]。Emm包括內(nèi)能Einternal(鍵能伸縮Ebond、鍵角彎曲能Eangle和二面角扭轉(zhuǎn)能Edihedral)，靜電能Eelectrostatic和范德華能EvdW[30]。Gsolv包括極性溶劑化自由能GGB和非極性溶劑化自由能GSA[30]。極性溶劑化自由能GGB由廣義波恩(Generalized Born, GB)[31]模型計(jì)算得出，而非極性溶劑化自由能ΔGSA則是使用LCOP方法[32]計(jì)算溶劑可及表面積(solvent accessible surface area, SASA)，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式GSA=γSASA+b計(jì)算得出[33]；本實(shí)驗(yàn)中，水分子探測(cè)半徑為1.4 ?[34]，表面張力常數(shù)γ為0.0072 kcal·mol-1·nm-2[35]，常數(shù)b為0。使用MM-GBSA方法在40～80 ns軌跡中選取500幀軌跡，計(jì)算Emm、GGB、GSA和每個(gè)氨基酸殘基對(duì)結(jié)合自由能的能量貢獻(xiàn)。構(gòu)象熵變-TΔS采用AMBER12中Nmode模塊的正則模分析方法計(jì)算[30]，由于熵的計(jì)算量龐大[35]，實(shí)驗(yàn)從40～80 ns軌跡中每800 ps選取1幀，共選取50幀來(lái)計(jì)算熵。

2 結(jié)果與討論(Results and discussions)

2.1 復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

均方根偏差(root-mean-square deviation, RMSD)可以反映出整個(gè)模擬過(guò)程蛋白結(jié)構(gòu)的變化。實(shí)驗(yàn)使用AMBER中的ptraj程序計(jì)算了蛋白質(zhì)主鏈原子(Cα, C, N)的RMSD值來(lái)表征整個(gè)體系的平衡與穩(wěn)定性，并計(jì)算處于活性位點(diǎn)距離配體在4 ?以內(nèi)的氨基酸殘基Cα原子的RMSD值來(lái)表征結(jié)合模式的穩(wěn)定性，圖3所示。圖3a表明，4個(gè)復(fù)合物體系的RMSD值在模擬6 ns之后均未發(fā)生顯著的變化且漲落范圍低于1.8 ?，這說(shuō)明H874Y和T877A在分別結(jié)合DHT或p,p′-DDE之后未發(fā)生劇烈的構(gòu)象變化，2種復(fù)合物激動(dòng)構(gòu)象的穩(wěn)定性與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，也說(shuō)明了p,p′-DDE在H874Y及T877A中是激動(dòng)作用。但還應(yīng)注意到每個(gè)復(fù)合的RMSD值都存在差異性，其中，p,p′-DDE-T877A復(fù)合物主鏈原子RMSD值最高，說(shuō)明T877A在結(jié)合p,p′-DDE之后構(gòu)象變化最大，整個(gè)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性低于其他3個(gè)復(fù)合物體系；H874Y和T877A與DHT結(jié)合后，RMSD值均比與p,p′-DDE復(fù)合物低，這反應(yīng)了DHT與AR突變體的結(jié)合比p,p′-DDE更穩(wěn)定。此外，p,p′-DDE-H874Y復(fù)合物蛋白質(zhì)主鏈原子在30～36 ns之間發(fā)生了一定程度的波動(dòng)，之后持續(xù)保持穩(wěn)定。進(jìn)一步分析了活性區(qū)域附近氨基酸及配體自身的RMSD曲線，如圖3b及3c所示。可以看出，相比與DHT，2個(gè)p,p′-DDE復(fù)合物中結(jié)合位點(diǎn)附近氨基酸的RMSD的波動(dòng)幅度較大，這反映出p,p′-DDE在模擬過(guò)程中經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)調(diào)整，由于PDB中并沒(méi)有p,p′-DDE及AR的晶體結(jié)構(gòu)，所構(gòu)建的p,p′-DDE復(fù)合物在模擬前僅經(jīng)過(guò)分子力學(xué)優(yōu)化，因此p,p′-DDE在MD模擬過(guò)程中的構(gòu)象變化也說(shuō)明了MD模擬能夠更好地表現(xiàn)受體配體之間的誘導(dǎo)-契合效應(yīng)。為了避免初始模型的不準(zhǔn)確及模擬本身升溫等因素的影響，我們選取軌跡中最平穩(wěn)的40～80 ns之間的軌跡進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析。

圖3 (a)p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A、DHT-H874Y和DHT-T877A復(fù)合物體系的雄激素受體(AR)主鏈原子隨時(shí)間變化的RMSD曲線；(b)處于活性位點(diǎn)距離配體在4 ?之內(nèi)的氨基酸Cα原子隨時(shí)間變化的RMSD曲線；(c)配體隨時(shí)間變化的RMSD曲線Fig. 3 RMSDs time profile of (a) backbone atoms of the androgen receptor (AR); (b) Cα atoms for the residues around 4 ? of the ligand; (c) ligand

2.2 聚類分析

實(shí)驗(yàn)使用AverageLinkage算法對(duì)40～80 ns的軌跡進(jìn)行了聚類分析，按照Cα原子的RMSD值聚類，最終得到5個(gè)構(gòu)象的集合。其中，p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A、DHT-H874Y和DHT-T877A這4個(gè)體系最大聚類構(gòu)象集合所占總的構(gòu)象比例分別為74.3%、56.7%、91.8%和99.7%，這也反映出在模擬的后半程，整個(gè)復(fù)合物非常穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)選擇軌跡中占有率最高的構(gòu)象作為最具有代表性構(gòu)象，將其與初始構(gòu)象進(jìn)行對(duì)比，如圖4所示。從圖4a中可以看出，DHT-AR復(fù)合物體系未發(fā)生明顯的變化，且DHT的位置也基本穩(wěn)定；而在p,p′-DDE-AR的2個(gè)突變體復(fù)合物中(圖4b)，p,p′-DDE在結(jié)合口袋處的位置均存在較大的偏移，這意味著p,p′-DDE與AR的結(jié)合不如DHT穩(wěn)定。

2.3 MM-GBSA結(jié)合自由能及重要氨基酸的識(shí)別

為了系統(tǒng)性地研究p,p′-DDE與H874Y及T877A結(jié)合活性的來(lái)源，通過(guò)MM-GBSA方法從能量角度來(lái)探究p,p′-DDE與H874Y及T877A的相互

作用。表1列出了p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A、DHT-H874Y和DHT-T877A的結(jié)合自由能，分別為-25.08 kcal·mol-1、-24.82 kcal·mol-1、-33.58 kcal·mol-1和-32.44 kcal·mol-1，計(jì)算結(jié)果有利于受體與配體的結(jié)合，且順序與實(shí)驗(yàn)活性順序相一致，這進(jìn)一步驗(yàn)證了p,p′-DDE是AR突變體的弱激動(dòng)劑。對(duì)于4個(gè)復(fù)合物體系，范德華相互作用(ΔEvdW)是結(jié)合自由能最大來(lái)源，是維持結(jié)合穩(wěn)定性的主要驅(qū)動(dòng)力；同時(shí)，范德華相互作用在不同化合物之間也存在差異，主要是因?yàn)閜,p′-DDE與DHT自身分子性質(zhì)不同所造成。p,p′-DDE中通過(guò)一個(gè)sp2雜化的碳原子將2個(gè)對(duì)位氯取代的苯環(huán)相互連接在一起，看似對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，實(shí)則由于苯環(huán)和sp2雜化碳形成的σ鍵以及乙烯基碳與氯形成的σ鍵可以沿著鍵軸旋轉(zhuǎn)而導(dǎo)致2個(gè)苯環(huán)并非在一個(gè)平面上，即該分子本身就是極性分子，具有永久偶極。而DHT的甾核具有較高的結(jié)構(gòu)剛性，可塑性低于p,p′-DDE。另外，DHT多為飽和C原子使得其極性較低與口袋更匹配，因此DHT與受體結(jié)合時(shí)具有更強(qiáng)的范德華作用。對(duì)比p,p′-DDE與DHT復(fù)合物，靜電能(ΔEelectrostatic)的差異巨大，是導(dǎo)致2個(gè)化合物結(jié)合活性不同的重要原因。p,p′-DDE與H874Y及T877A的靜電能僅為-2.48 kcal·mol-1及-2.63 kcal·mol-1，說(shuō)明p,p′-DDE與突變體之間幾乎沒(méi)有穩(wěn)定的靜電相互作用如氫鍵、鹽橋等。而由于化合物處于AR的疏水空腔，考慮極性溶劑化自由能之后，對(duì)整體的極性相互作用(ΔGpol)而言，DHT-H874Y的ΔGpol是有利于結(jié)合的(-1.82 kcal·mol-1)，但DHT-T877A(0.43 kcal·mol-1)、p,p′-DDE-H874Y(3.13 kcal·mol-1)和p,p′-DDE-T877A(3.41 kcal·mol-1)復(fù)合物的ΔGpol均不利于結(jié)合。對(duì)于DHT-T877A復(fù)合物來(lái)說(shuō)，這表明突變一方面減弱了受體配體之間的靜電相互作用，另一方面也帶來(lái)了更為不利的極性溶劑化效應(yīng)。而相對(duì)于p,p′-DDE-H874Y而言，p,p′-DDE-T877A也含有更為不利的極性溶劑化作用。由于T877A突變處于結(jié)合口袋區(qū)域，這反映出T877A的突變加劇了化合物與口袋之間的不兼容性。上述結(jié)果說(shuō)明p,p′-DDE是AR這2種突變體的弱激動(dòng)劑，其親和性較DHT低的原因主要是靜電相互作用較弱，另一方面p,p′-DDE較少的非極性基團(tuán)也導(dǎo)致其與AR突變體的范德華相互作用偏低。

通過(guò)比較p,p′-DDE-H874Y與p,p′-DDE-T877A，我們發(fā)現(xiàn)p,p′-DDE對(duì)H874Y表現(xiàn)出更高的親和性。通過(guò)對(duì)比可以看出，2個(gè)突變體之間的結(jié)合自由能差別很小，主要的區(qū)別在于溶劑化作用，p,p′-DDE與H874Y的溶劑化能為0.39 kcal·mol-1，而p,p′-DDE與T877A的溶劑化能為1.09 kcal·mol-1。這更進(jìn)一步說(shuō)明了T877A突變引起了結(jié)合口袋環(huán)境的改變，導(dǎo)致p,p′-DDE與結(jié)合口袋的不兼容性，和我們之前的結(jié)論相一致。T877A對(duì)p,p′-DDE結(jié)合活性的影響更為明顯。

圖5 單個(gè)氨基酸殘基的結(jié)合自由能Fig. 5 Binding free energy of individual amino acid residue

表1 復(fù)合物DHT-H874Y、DHT-T877A、p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A之間的結(jié)合自由能(kcal·mol-1)Table 1 The calculated binding free energies of DHT-H874Y, DHT-T877A, p,p′-DDE-H874Y and p,p′-DDE-T877A (kcal·mol-1)

Note: ①ΔGpol=ΔEelectrostatic+ΔGGB; ②ΔGnonpol=ΔEvdW+ΔGSA; ③ΔG=ΔEvdW+ΔEelectrostatic+ΔGGB+ΔGSA; ④ΔΔG=ΔG -TΔS.

為了進(jìn)一步確定在結(jié)合過(guò)程中的關(guān)鍵氨基酸，我們將結(jié)合自由能總能量分解到每個(gè)單獨(dú)的氨基酸上。圖5分別標(biāo)出了4個(gè)體系中對(duì)結(jié)合自由能貢獻(xiàn)值小于-0.80 kcal·mol-1的重要氨基酸殘基。DHT-H874Y、DHT-T877A、p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A重要氨基酸數(shù)目分別為12個(gè)、13個(gè)、9個(gè)及7個(gè)。顯然，DHT與H874Y及T877A中更多的氨基酸存在分子間相互作用，與AR結(jié)合的更為緊密。從圖5中還可以看出，L704、M742、M745、F764、L873在4個(gè)復(fù)合物的配體受體結(jié)合過(guò)程中均有重要貢獻(xiàn)，表明了這些氨基酸對(duì)化合物與AR的2種突變體結(jié)合的重要性，而這些氨基酸均為非極性氨基酸，也再一次驗(yàn)證了非極性相互作用對(duì)穩(wěn)定配體受體相互作用的重要性。尤其應(yīng)當(dāng)注意到L704、M745、L873這3個(gè)氨基酸對(duì)突變體與p,p′-DDE的自由能貢獻(xiàn)非常顯著，是p,p′-DDE與突變體結(jié)合極為重要的氨基酸。相對(duì)于DHT而言，p,p′-DDE并沒(méi)有貢獻(xiàn)顯著的極性氨基酸，而DHT則與N705有很強(qiáng)的分子間相互作用。除此之外，對(duì)比p,p′-DDE-H874Y與p,p′-DDE-T877A可以看出(如圖6所示)，p,p′-DDE與H874Y之間有更多的非極性氨基酸存在分子間相互作用，也表明了p,p′-DDE與H874Y的結(jié)合口袋更兼容。

從分解能中也可以確定每個(gè)氨基酸與p,p′-DDE及DHT之間的作用方式，如圖7所示。對(duì)p,p′-DDE來(lái)說(shuō)，不論是與H874Y還是T877A結(jié)合，氨基酸的范德華力均是其自由能貢獻(xiàn)的主要來(lái)源。而對(duì)于DHT-H874Y來(lái)說(shuō)，N705和T877有顯著的極性自由能貢獻(xiàn)(分別為-3.74 kcal·mol-1，-2.93 kcal·mol-1)。但在p,p′-DDE-H874Y復(fù)合物中，T877的主要作用方式是非極性相互作用，表明了該氨基酸與p,p′-DDE之間沒(méi)有穩(wěn)定的靜電作用。在p,p′-DDE-AR復(fù)合物中，T877A的突變直接破壞了原本T877對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)，導(dǎo)致了配體與T877A結(jié)合的減弱。

2.4 氫鍵相互作用分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步計(jì)算了80 ns模擬過(guò)程中p,p′-DDE和DHT與H874Y及T877A之間的氫鍵。在氫鍵的判定中以原子間距離小于3 ?，角度大于130°作為統(tǒng)計(jì)占有率的臨界值。從表2和圖6可知，在DHT-H874Y復(fù)合物體系中，DHT的17-OH基團(tuán)與N705、T877形成2個(gè)非常穩(wěn)定的氫鍵，占有率分別為94.68%和84.26%。在DHT-T877A復(fù)合物體系中，DHT的17-OH基團(tuán)與N705形成了一個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，占有率達(dá)到91.61%，而T877A的突變直接破壞了另一條氫鍵。計(jì)算結(jié)果與前面靜電能和單個(gè)氨基酸能量分析所得到的結(jié)論相一致。此外，DHT的O3原子分別與一分子結(jié)晶水、R752及Q711形成了不穩(wěn)定的氫鍵(數(shù)據(jù)未列出)。這種氫鍵相互作用的現(xiàn)象在晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)中也被報(bào)道過(guò)[5]。p,p′-DDE與H874Y及T877A之間并未形成較為穩(wěn)定的氫鍵，從而降低了總的結(jié)合能。Askew等[36]發(fā)現(xiàn)在H874Y突變體中，突變后的Y874與處在H4上的Y739之間形成了穩(wěn)定的氫鍵，能夠促進(jìn)AR activation function 2(AF-2)區(qū)域與共激活因子的結(jié)合，提高AR的轉(zhuǎn)錄活性。本研究發(fā)現(xiàn)，H874Y的Y874與Y739之間形成了占有率為80%的氫鍵(如圖6所示)，而在T877A中卻并未發(fā)現(xiàn)此氫鍵，此計(jì)算結(jié)果進(jìn)一步支持了細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。之前的分析表明DHT在整個(gè)模擬過(guò)程的構(gòu)象非常穩(wěn)定而p,p′-DDE并不穩(wěn)定，這說(shuō)明氫鍵的形成能直接穩(wěn)定配體與AR結(jié)合口袋之間的相互作用，對(duì)配體與受體的結(jié)合起到了重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)DHT-H874Y、DHT-T877A、p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A這4個(gè)復(fù)合物進(jìn)行了長(zhǎng)程MD模擬，同時(shí)使用MM-GBSA方法計(jì)算了復(fù)合物之間的結(jié)合自由能，探討了p,p′-DDE與AR的2種突變體H874Y及T877A激動(dòng)性結(jié)合的分子機(jī)制。模擬結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。計(jì)算表明，范德華相互作用是維持p,p′-DDE和DHT與AR突變體結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力。相比于p,p′-DDE，DHT與AR之間形成了非常穩(wěn)定的氫鍵，具有極為有利的靜電相互作用，這種差異是導(dǎo)致p,p′-DDE與DHT結(jié)合活性差異的重要原因。p,p′-DDE與H874Y的結(jié)合口袋更為融洽，具有更為有利的溶劑化能，T877A的突變則加劇了p,p′-DDE與結(jié)合口袋的不兼容性。MM-GBSA結(jié)果確定了p,p′-DDE與H874Y及T877A結(jié)合的重要氨基酸殘基，尤其是L704、M745、L873對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)非常顯著。以上結(jié)果基于分子層面給出了p,p′-DDE與H874Y及T877A之間的結(jié)合機(jī)制，對(duì)深入理解p,p′-DDE經(jīng)由AR介導(dǎo)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾效應(yīng)并為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該污染物在不同人群中健康風(fēng)險(xiǎn)的差異提供了必要理論支持和有益借鑒。

表2 主要?dú)埢臍滏I生成情況Table 2 The hydrogen bonds of the key residues

圖2 晶體結(jié)構(gòu)中配體與重新對(duì)接后配體姿態(tài)與構(gòu)象的比較Fig. 2 The superposition of initial crystal structureand the re-docking conformation

圖4 (a) DHT-H874Y和DHT-T877A軌跡的聚類分析； (b) p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A軌跡的聚類分析注：藍(lán)色表示最具有代表性構(gòu)象，綠色代表初始構(gòu)象。Fig. 4 Cluster analysis of (a) DHT-H874Y and DHT-T877A; (b) p,p′-DDE-H874Y and p,p′-DDE-T877ANote: Blue represent the most representative structure; green represent the initial structure.

圖6 重要氨基酸的分布及重要?dú)滏I的形成(氫鍵以藍(lán)色虛線表示)Fig. 6 Distributions of key amino acid residues and hydrogen bonds colored by blue line

圖7 配體(p,p′-DDE和DHT)與H874Y/T877A關(guān)鍵氨基酸結(jié)合的能量貢獻(xiàn)Fig. 7 The energy contributions to the binding between key residues of H874Y/T877A and ligand (p,p′-DDE and DHT)

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◆

TheoreticalInvestigationonAgonismMechanismofp,p′-DDEviaInteractingwithAndrogenReceptorMutantsH874YandT877A

Zhu Jinghan1,2, Xue Qiao1,2, Liu Xian1,2, Zhang Aiqian1,2,*

1. State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing100085, China2. College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing100049, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170114002朱婧涵, 薛嶠, 劉嫻, 等. p,p′-DDE與雄激素受體突變體H874Y及T877A激動(dòng)性作用機(jī)制的理論研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(3): 214-224

2017-01-14錄用日期2017-03-08

1673-5897(2017)3-214-11

X171.5

A

張愛(ài)茜(1972—)，女，博士，研究員，主要研究方向?yàn)槔碚摥h(huán)境化學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21621064, 21507152)；中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)課題(XDB14030500)

朱婧涵(1992-)，女，碩士，研究方向?yàn)槔碚摥h(huán)境化學(xué)，E-mail: nanaqq7@hotmail.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: aqzhang@rcees.ac.cn

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