垃圾滲濾液中典型內分泌干擾物質(EDCs)細胞毒性分析

侯昌成，趙玲,*，尹平河，陸鋼

1. 暨南大學環境學院，廣州環境暴露與健康重點實驗室，廣東環境污染與健康重點實驗室，廣州 5106322. 暨南大學生命科學技術學院，暨南大學分析測試中心，廣州 510632

垃圾滲濾液中典型內分泌干擾物質(EDCs)細胞毒性分析

侯昌成1，趙玲1,*，尹平河2,#，陸鋼1

1. 暨南大學環境學院，廣州環境暴露與健康重點實驗室，廣東環境污染與健康重點實驗室，廣州 5106322. 暨南大學生命科學技術學院，暨南大學分析測試中心，廣州 510632

垃圾滲濾液的人類健康風險評估日益受到人們重視，也成為研究熱點。本文采用一種新型高級氧化技術UV-Fenton處理滲濾液，并用人體乳腺癌細胞(MCF-7)評估處理過程中滲濾液原液以及滲濾液中典型內分泌干擾物質(EDCs)的細胞毒性，對垃圾滲濾液中EDCs的細胞毒性和變化規律進行了研究。結果表明滲濾液中的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、雙酚A(BPA)、壬基酚(NP)是產生細胞毒性的主要物質，其毒性大小為DBP>BPA>NP。在同樣的氧化降解過程中顯示出不同毒性變化規律，通過GC-MS分析，結果顯示UV-Fenton過程中產生了大量的中間產物，這也是引起毒性變化的主要原因。實驗結果也說明垃圾滲濾液細胞毒性可以通過UV-Fenton過程有效去除。

垃圾滲濾液；內分泌干擾物質；人體乳腺癌細胞；細胞毒性；高級氧化過程；UV-Fenton；中間產物

Received15 January 2017accepted20 April 2017

Abstract: Recently, the health risk assessment on the landfill leachate has attracted increasing attentions and has become a research focus. In the present study, a novel advanced oxidation technology (UV-Fenton technology) was adopted to treat the leachate, and the cell toxicity of raw leachate and typical EDCs in the leachate in the treatment process has been evaluated by using human breast cancer cells (MCF-7). The results indicated that di-butyl phthalate (DBP), bisphenol A (BPA) and nonylphenol (NP) in the leachate were main substances which have significant cytotoxicity on MCF-7 cells. The toxicity variations of these three chemicals were different in the same oxidative degradation process, and the toxicity order was DBP > BPA > NP. According to the GC-MS analysis results, a great amount of intermediate products have been produced in UV-Fenton process, which may be a major reason that induced toxicity variations. The results implied that UV-Fenton technology is an effective method to reduce toxicity of landfill leachate.

Keywords: landfill leachate; endocrine disrupting chemicals; MCE-7; cytotoxicity; advanced oxidation process; UV-Fenton; intermediate product

垃圾滲濾液是指垃圾填埋場中垃圾本身含有的水分、進入填埋場的雨雪水及其他水分，扣除垃圾、覆土層的飽和持水量后，并經歷垃圾層和覆土層而形成的一種高濃度的有機廢水[1]。以前少量產生，直接并入市政污水管網，但因含高濃度無機物和有機物，尤其常常含有重金屬和持久性有機污染物(POPs)等有毒有害難生化難降解的污染物，很容易引起市政污水處理體系的癱瘓，影響污水處理廠的正常運行[2]。并且里面含有內分泌干擾物質(EDCs)，對人類身體健康和對生態系統都存在極大的威脅[3]。內分泌干擾物質是一類能干擾人體內分泌系統的外源性化學物質，目前已知的已經有100多種，比如鄰苯二甲酸酯類(PAEs)、雌激素酮(E1)、雙酚A(BPA)、壬基酚(NP)、雌二醇(E2)等[4]會引起患癌癥的幾率增加，最主要的還會使人的生殖行為發生異常，通過遺傳影響下一代的健康[5]。

隨著垃圾填埋場運行時間的增長，垃圾滲濾液中EDCs的產生量會逐年積累，現在廣州運行超過10年的垃圾填埋場有3家，每年產生大量的垃圾滲濾液。目前對于垃圾滲濾液中EDCs還有沒針對性的去除辦法，現在常見的對垃圾滲濾液中污染物無選擇性的處理方法有生化法、物理化學方法、膜過濾法、高級氧化方法等[6-9]。對于處理的指標通常也是常見的水質指標氨氮、總氮、總磷、COD等，可詳見于垃圾滲濾液出水水質指標《生活垃圾填埋場污染控制標準(GB 16889—2008)》，從標準中可以清楚查到關于現有和新建生活垃圾填埋場水污染物排放濃度限值。結合目前的研究熱點可以看出對垃圾滲濾液的研究都是偏向提高處理效率，而忽略了最重要的毒性評價過程[10-12]。即使經過了以上的水處理過程，還可能存在這樣的問題：常規水質指標都達標后，出水是否就沒有細胞毒性，對人類身體健康和生態環境沒有潛在威脅。王桂芳等[13]研究了用活性炭、Fenton、UV-Fenton方法初步處理垃圾滲濾液后，仍然會檢測到細胞毒性和遺傳毒性。Ahmed等[4]也證實即使經過處理后，確實還會有細胞毒性物質殘留。而且滲濾液中成分極其復雜，里邊的內分泌干擾物質對人體的危害往往也不是某一種單獨作用的結果，需要一種新的評價方法來彌補傳統標準的不足。本文選用人體乳腺癌細胞(MCF-7)來評價垃圾滲濾液的綜合細胞毒性。用細胞毒性直接評估處理過程中毒性變化，這對人類健康風險評價具有重要指導意義。Soto等[14]在1995年首次用細胞毒性來檢測表征環境污染物。Conley等[15]檢測了飲用水經過凈化后，水中細胞毒性的變化。Belhaj等[16]也發現即使經過處理的污水中也可能會存在細胞毒性。Aghajanpour-Mir等[17]直接用MCF-7檢測分析了雙酚A的細胞毒性。本文選用的MCF-7細胞有雌激素受體(CRs)可以全面地反映水樣中綜合內分泌干擾物質的毒性[18-19]。并且采用了目前應用最廣泛的高級氧化技術UV-Fenton技術，對垃圾滲濾液中典型內分泌干擾物質進行分階段的氧化實驗，用人體乳腺癌細胞(MCF-7)評價處理過程中垃圾滲濾液細胞毒性的變化。用氣相色譜質譜聯用技術(GC/MS)分析了降解過程中可能存在的中間產物，探究引起細胞毒性變化的根本原因。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 垃圾滲濾液的采集

實驗用滲濾液采自廣州市某垃圾填埋場，占地約23.11萬m2，1988年開始運行，2002年停止運行封場。現階段垃圾滲濾液產生量約為2 t·d-1[20]。2016年3、4、5、6月在該垃圾填埋場滲濾液匯總出口處收集，收集后存儲于4 ℃低溫環境下。

滲濾液的物化參數如pH、導電性、色度和濁度等，采用一臺多功能水質監測儀器(GDYS-201M，Little Swan Instruments Co. Ltd)進行現場檢測[13]。

1.2 滲濾液的高級氧化實驗

UV-Fenton氧化反應實驗在一個2 L的封閉容器中進行，裝置正中央中配備低壓汞燈(深圳Dohill公司，0.25 w·cm-2)，底部配備低速攪拌器[21]。取1 L垃圾滲濾液樣品，用濃硫酸調節pH到2，0.45 μm濾膜過濾，然后加入2 g FeSO4·7H2O，使其濃度達到2 g·L-1后，紫外燈預熱5 min后加入樣品開始氧化，分別在0、5、10、15、30、60 min取出50 mL反應水樣做進一步檢測。

1.3 滲濾液中典型EDCs的GC/MS表征

3種典型EDCs分別選擇鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、雙酚A(BPA)、壬基酚(NP)。DBP的萃取采用液液萃取，BPA和NP的檢測方法參考陳茹等[22]并做相應改進，取20 mL滲濾液樣品，用屈臣氏水稀釋到500 mL，加入氯化鈉防止乳化，每次加入20 mL二氯甲烷萃取3次，收集3次萃取的有機相，經無水硫酸鈉干燥后收集用旋轉蒸發儀35 ℃蒸至小于1 mL，經2次正己烷溶劑置換。在10 mm×300 mm的玻璃層析柱底部加入玻璃棉，然后由下至上逐一添加1～2 cm的無水硫酸鈉，8 g活化硅膠(100目)，1～2 cm無水硫酸鈉，過程中防止氣泡產生。先用20 mL正己烷淋洗，然后加入提取液，用10 mL二氯甲烷/正己烷(3/7, V/V)洗脫，棄去淋洗液，然后40 mL二氯甲烷/正己烷(8/2, V/V)洗脫，收集淋洗液，正己烷溶劑置換，等待上機檢測[23]。

檢測條件為：色譜柱(DB-5 ms, 30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度280 ℃，載氣流速0.97 mL·min-1，進氧量1 μL，無分流進樣。升溫程序起始溫度100 ℃然后10 ℃·min-1升到200 ℃，保持2 min，再以15 ℃·min-1升到280 ℃。溶劑延遲3 min，離子源溫度220 ℃，接口溫度280 ℃[24-26]。實驗同時用XAD-8 (Sigma-3025-U, Amberlite, USA)樹脂分離腐殖酸(HA)，檢測細胞毒性[27-28]。

模擬EDCs溶液的配制，3種標準品都是購自A ChemTek, Inc. (Worcester, USA)，用甲醇先溶解配成100 mg·L-1的標準儲備液體，然后溶解稀釋到屈臣氏純水中，濃度與上述滲濾液中檢測到的濃度相等。氧化過程與1.2步中垃圾滲濾液的高級氧化過程完全一樣，并加空白(純水)試驗。

1.4 滲濾液和模擬液的細胞毒性實驗

細胞培養：細胞毒性試驗是在暨南大學醫學院試驗中心完成，MCF-7細胞購自中山大學醫學院附屬醫院。細胞傳代培養，貼壁后，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，并凍存保種[29]。

細胞毒性實驗：1.3步萃取的以及模擬配制的3種典型EDCs分別用二甲基亞砜(DMSO)作溶劑置換，用細胞培養液倍比稀釋至含DMSO 0.1%(體積分數)以下開始細胞暴露毒性實驗，并用E2做陽性對照組。實驗分為實驗組(細胞 + 染毒溶液 + 培養基 + MTT + DMSO)，空白對照組(細胞 + 培養基 + MTT + DMSO)，負對照組(培養基 + MTT + DMSO)共同培養在一個96孔板里，培養48 h后，加入20 μL MTT試劑，繼續培養4～6 h后棄上清，加入150 μL DMSO溶解[30]。MTT和DMSO僅僅在最后檢測顯色階段加入，用熒光酶標儀(Multiskan MK3, Thermo Fisher, USA)分別檢測實驗組、空白對照組和負對照組在波長490 nm時的吸光度，最終計算MCF-7增殖效應(proliferation effect, PE)值，即細胞毒性值。當PE值大于100%時，值越大表示毒性越大；當PE值小于100%時，值越小，表示毒性越大。計算公式如下：

PE= (實驗組數據-負對照組數據)/(空白對照組數據-負對照組數據) × 100%

1.5 數據分析

用于檢測細胞毒性的MCF-7細胞暴露染毒時間為48 h，每個處理組設置3組平行實驗，測定細胞毒性的細胞都在一塊96孔板上完成。測定結果都表示為平均值±標準偏差，用SPSS軟件進行單因素方差分析，并用ANOVA檢驗顯著性差異水平(P<0.05)。

2 結果(Results)

2.1 垃圾滲濾液氧化前后的細胞毒性對比

垃圾滲濾液經過UV-Fenton處理前后的細胞毒性結果如圖1所示，對照組中垃圾滲濾液的濃度為0%，表現出正常細胞的生長狀況，理論上正常細胞的細胞毒性值為100%。

氧化處理前隨著濃度(V/V)的增加，細胞首先在10%、15%濃度的時候表現出明顯的增殖毒性，大小分別為120%和109%，尤其是10%的時候表現出顯著性差異。濃度大于20%以后，細胞毒性小于100%，即抑制細胞的增殖，并且隨濃度的增加抑制作用明顯增加，濃度30%時達到最大，其細胞毒性值為24%。經過氧化處理后，細胞毒性有時會比處理前有所上升，如濃度在10%和15%時處理后表現出更強的細胞毒性，然后隨濃度增大趨向于正常增殖水平100%；從圖1中可以看出，經過氧化處理后，含滲濾液大于20%時，細胞抑制作用經氧化處理后在減弱，即細胞毒性減弱。

圖2 滲濾液中典型污染物細胞毒性分析注：A圖，不同污染物的細胞毒性；B圖，3種典型污染物細胞毒性貢獻率。CON為空白對照；HA為腐殖酸；E2為雌二醇，作陽性對照。 *P<0.05。Fig. 2 Analysis of proliferation effect of typical pollutants in leachateNote: A, proliferation effect of typical pollutants in leachate; B, analysis of the effect contribution of each typical pollutant to PE of leachate. CON stands for control group; HA stands for humic acid; E2 stands for estradiol used as positive control. *P<0.05.

表1 滲濾液基本理化參數Table 1 Physicochemical parameters of leachate in this study

2.2 滲濾液中典型EDCs的分析

(1)處理前后水質參數分析

垃圾滲濾液中典型EDCs以及基本參數分析見表1，本實驗中垃圾滲濾液經過初步超濾，但色度較深達到5 600 PtCo，COD也高達2 189 mg·L-1，這就說明含有很多有機污染物，3種典型內分泌干擾物質中DBP含量最高，達到215 μg·L-1，另外BPA、NP也分別達到了18 μg·L-1和27 μg·L-1。經過UV-Fenton高級氧化處理后3種EDCs的濃度都達到了檢測限以下，不能被檢出。

(2)細胞毒性貢獻率分析

對垃圾滲濾液中典型的內分泌干擾物質分別做MCF-7的細胞暴露實驗，結果如圖2所示，對照組增值率為正常值100%，腐殖酸(HA)跟對照組比沒有顯著性差異，NP、BPA、DBP都表現出了明顯的細胞毒性，NP值最低，為121%；BPA其次，為126%；細胞毒性最高的是DBP，為136%，其中陽性對照為141%。說明滲濾液中這3類EDCs都有明顯的細胞毒性。以它們超出100%的部分計算它們在滲濾液的貢獻率，3種EDCs的貢獻率分別為DBP 46%、BPA 28%、NP 23%。

2.3 模擬EDCs的細胞毒性分析

對垃圾滲濾液中3種典型EDCs分別做UV-Fenton過程中的細胞毒性檢測，結果如圖3、4、5。從圖3中可以看出0 min時的NP細胞毒性值最高，達到了115%，其后隨著高級氧化處理時間的增長，細胞毒性值不斷降低，說明毒性一直在下降，當處理到30 min的時候，已經沒有明顯的細胞毒性，60 min時，達到正常水平100%左右。

圖3 氧化處理時間對NP細胞毒性的影響(*P<0.05)Fig. 3 The proliferation effect of NP with different UV-Fenton treatment time (*P<0.05)

圖4 氧化處理時間對BPA細胞毒性的影響(*P<0.05)Fig. 4 The proliferation effect of BPA with different UV-Fenton treatment time (*P<0.05)

圖5 氧化處理時間對DBP細胞毒性的影響(*P<0.05)Fig. 5 The proliferation effect of DBP with different UV-Fenton treatment time (*P<0.05)

BPA的氧化過程顯示出與NP不同的趨勢，如圖4所示：氧化前10 min的MCF-7細胞毒性維持在0 min的水平，基本保持不變，其中最高值出現在5 min的119%，高于NP的最大細胞毒性值115%，15 min時開始明顯下降到109%，直到60 min時不表現出細胞毒性。

與前兩者不同，DBP的細胞毒性在10 min時有一個峰值，達到132%。如圖5所示，從0 min的124%開始，到10 min，細胞毒性表現出上升的趨勢，15 min時后迅速下降到118%，到30 min基本穩定，60 min時顯示正常增殖水平。從圖中看出DBP的細胞毒性下降階段主要集中在10～30 min之間。垃圾滲濾液中3種典型EDCs對MCF-7細胞毒性大小為DBP>BPA>NP。

圖6 3種典型內分泌干擾物(EDCs)氧化過程中間產物分析注：UV-Fenton處理時間10 min；峰1～12為中間產物。Fig. 6 Intermediates analysis of three typical endocrine disrupting chemicals (EDCs) in leachate by GC/MSNote: degradation time is 10 min; peak 1-12 are the different intermediates.

2.4 氧化過程的中間產物分析

用UV-Fenton處理垃圾滲濾液中3種典型EDCs 10 min后，通過GC/MS技術分析降解過程中物質變化情況，結果如圖6所示。可以看出，除了原來3種物質，色譜圖中出現了很多新色譜峰1～12，說明在降解10 min后產生了一些新的中間產物，結合質譜圖分析，推斷出中間產物中含有鄰苯二甲酸二乙酯、羥基苯乙酮、羥基苯甲醛、羥基苯甲酸、甲酸、苯酚等毒性更高的物質。隨著氧化時間的增長，這些中間產物被降解掉，最終轉化為無毒無害的二氧化碳和水。

3 討論(Discussion)

研究已表明垃圾滲濾液確實存在細胞毒性，濃度高時候會抑制細胞的生長，本實驗中垃圾滲濾液原液濃度在10%(V/V)的時候(圖1)，對乳腺癌細胞產生了明顯的細胞毒性，當濃度達到20%(V/V)時，就表現出了細胞抑制效應，這與王桂芳等[3]的研究中，垃圾滲濾液濃度20%(V/V)時候細胞活性受到明顯抑制的結果相吻合。垃圾滲濾液的成分非常復雜，里面含有的有毒有害有機物有100多種，綜合分析垃圾滲濾液中的本底物質與典型EDCs發現，滲濾液里主要有機組成成分大致可分為腐殖酸(HA)、鄰苯二甲酸酯類(PAEs)、多環芳烴(PAHs)、烷基酚、雙酚A等，其中DBP、BPA、NP是在滲濾液中被普遍檢出的、含量相對較高的3類典型的EDCs[2, 31-35]。Asakura等[36]對日本某垃圾填埋場滲濾液的研究表明，雙酚A和DBP的濃度特征顯著，高出地表水中的10倍、30倍。本實驗中DBP已經達到215 μg·L-1(表1)，研究表明，這類物質在即使在μg·L-1～ng·L-1水平，也能對人類和野生動物內分泌系統產生嚴重后果。

滲濾液模擬液的MCF-7細胞毒性實驗結果發現(圖2)，腐殖酸類物質是不具有細胞毒性的，NP、BPA、DBP可以對細胞產生明顯的細胞毒性(E2作為陽性對照)，其貢獻率分別為DBP 46%、BPA 28%、NP 23%，說明在滲濾液中處理過程中應該優先控制鄰苯二甲酸酯類物質的含量，其次是BPA，最后是直鏈類的烷基酚類化合物。

通過具體的氧化過程毒性試驗(圖3、4、5)，可以發現垃圾滲濾液中3類典型EDCs對MCF-7細胞的毒性變化過程。對于結構簡單的NP，UV-Fenton產生的羥基自由基(·OH)比較容易把它氧化，降解為無毒的小分子化合物，所以降解過程中，毒性變化曲線也比較簡單，細胞毒性規律呈現一直下降的趨勢，最終在60 min的時候對細胞不表現出明顯的細胞毒性。BPA和DBP結構相對復雜[37]，結果呈現出與NP截然不同的細胞毒性規律。BPA前10 min毒性與0 min相比基本沒發生什么變化，維持在118%的水平，可能因為其結構復雜，羥基自由基短時間內無法氧化徹底，隨著時間的累積，到15 min后，BPA開始大量分解，細胞毒性也開始急劇下降到109%，到60 min達到生物安全不顯示細胞毒性。DBP的毒性變化過程更復雜，從0 min的124%，經過5 min時候的128%，最終到達10 min時候的峰值132%，這個過程無法用前面的降解過程來解釋清楚。

借助GC/MS技術，我們萃取了降解過程中10 min時候的樣品進行分析(圖6)，結果發現除了0 min時刻的3種典型EDCs，中間多了很多雜質峰，分析結果發現，雖然BPA降解過程前階段濃度有下降，但是轉變成的新物質羥基苯甲醛等中間產物仍然具有細胞毒性，所以毒性基本不發生變化，DBP降解產生的鄰苯二甲酸二乙酯和其他中間產物比DBP具有更高的細胞毒性，所以雖然經過降解濃度減少，但是細胞毒性卻表現出上升的趨勢。在復雜有機物降解過程中毒性的變化過程是不確定的，眾所周知的苯酚變苯醌后毒性更強。綜合圖3、4、5我們發現雖然3類典型的EDCs都是具有細胞毒性的，但是經過UV-Fenton高級氧化過程處理60 min后，都可以達到細胞毒性安全[38-39]。

本實驗的研究結果表明，垃圾滲濾液原液存在明顯的細胞毒性，濃度低于15%(V/V)時產生細胞增殖毒性，大于20%(V/V)時，顯示細胞抑制毒性，并且隨著濃度的增加抑制毒性增加。垃圾滲濾液中3種典型的EDCs的細胞毒性呈現出DBP>BPA>NP的規律，并隨著UV-Fenton高級氧化處理時間的增長降低，在實際氧化過程中應優先考慮鄰苯二甲酸酯類污染物的氧化，處理足夠的時間，保證達到生物安全性。

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CytotoxicityAnalysisofTypicalEndocrineDisruptingChemicals(EDCs)inLandfillLeachate

Hou Changcheng1, Zhao Ling1,*, Yin Pinghe2,#, Lu Gang1

1. School of Environment, Guangzhou Key Laboratory of Environmental Exposure and Health, Guangdong Key Laboratory of Environmental Pollution and Health, Jinan University, Guangzhou 510632, China2. College of Life Science and Technology, Research Center of Analysis and Test, Jinan University, Guangzhou 510632, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170115005

2017-01-15錄用日期2017-04-20

1673-5897(2017)3-327-09

X171.5

A

趙玲(1965—)，女，教授，主要研究方向為海洋赤潮危害與治理，固體廢物處理處置和生態毒理研究，發表學術論文50余篇。

共同通訊作者簡介：尹平河(1959—)，男，教授，暨南大學水生生物(重點學科)專業博士生導師, 長期從事環境污染和赤潮治理的研究，曾先后多次獲得各種獎勵，發表學術論文100多篇。

國家自然基金項目(51508228，U113303，41676110)；廣東省產學研項目(2013B090600009)；廣東省科技計劃項目(2014A020217007)

侯昌成(1991- )，男，碩士研究生，助理研究員，研究方向為固體廢物處理處置和生態毒理學評價，E-mail: chas_hou@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zhaoling@jnu.edu.cn

#共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: tyinph @jnu.edu.cn

侯昌成, 趙玲, 尹平河, 等. 垃圾滲濾液中典型內分泌干擾物質(EDCs)細胞毒性分析[J]. 生態毒理學報，2017, 12(3): 327-335

Hou C C, Zhao L, Yin P H, et al. Cytotoxicity analysis of typical endocrine disrupting chemicals (EDCs) in landfill leachate [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 327-335 (in Chinese)