五氯酚(PCP)對雞肝癌細胞(LMH)毒性效應的機制研究

蔣鵬，盛南，王建設，戴家銀

中國科學院動物研究所中國科學院動物生態與保護生物學重點實驗室，北京 100101

五氯酚(PCP)對雞肝癌細胞(LMH)毒性效應的機制研究

蔣鵬，盛南，王建設，戴家銀*

中國科學院動物研究所中國科學院動物生態與保護生物學重點實驗室，北京 100101

五氯酚(pentachlorophenol, PCP)是一種持久性有機污染物，廣泛用于滅釘螺、木材防腐、除草劑等方面，由于PCP在環境中的持久性和生物累積性，其對生態環境和人類健康造成潛在危害。本文以雞肝癌細胞系(chicken hepatoma cells, LMH)為受試對象，探討了PCP對細胞色素P450(CYP450)和抗氧化系統的影響。MTT結果顯示LMH細胞經不同濃度PCP暴露后，呈現出先促進細胞增殖后抑制的J-型曲線，PCP對LMH細胞24 h的半數效應濃度(24 h-EC50)為427.52 μmol·L-1。LMH細胞在1.56、6.25、25、100 μmol·L-1PCP染毒條件下可增加細胞EROD、MROD、PROD和BFC活性，并可使CYP1A、1B、1C、2H及3A家族基因mRNA表達水平升高。LMH細胞在0.4～100 μmol·L-1PCP染毒下可顯著降低硫酸基轉移酶(SULT1B1和SULT 1C1)基因mRNA水平。此外，LMH細胞在6.25、25、100 μmol·L-1PCP染毒下可引起細胞內ROS升高，同時PCP(1.56～100 μmol·L-1)可顯著增加細胞內MDA含量和降低GSH/GSSH比值。這些結果表明細胞色素P450(CYP450)基因及酶活性的變化、細胞內ROS和MDA含量及GSH/GSSH可作為評價LMH細胞PCP毒性效應的敏感性生物標志物。此研究在細胞水平上利用多個評價指標研究PCP對細胞的毒性效應，為PCP環境風險評價提供依據。

五氯酚；雞肝癌細胞系；細胞色素P450；硫酸基轉移酶；氧化應激

Received12 December 2016accepted10 February 2017

Abstract: Pentachlorophenol (PCP), a persistent organic pollutant, has been used for wood preservation and as a herbicide and insecticide. Due to its persistence in the environment and bioaccumulation, PCP causes potential harm to the ecological environment and human health. In this study, chicken hepatoma cells (LMH) were used to explore the effect of PCP on antioxidant systems and cytochrome P450 (CYP450) levels. The results revealed that 1.56, 6.25, 25 and 100 μmol·L-1PCP could increase EROD, MROD, PROD and BFC levels, and remarkably upregulated the expressions of CYP1A, 1B, 1C, 2H and 3A families. Data obtained from 24 h-exposure studies demonstrated that 0.4-100 μmol·L-1PCP could decrease sulfotransferase (SULT1B1 and SULT 1C1) expression levels. When LMH cells were exposed to 6.25, 25, and 100 μmol·L-1PCP for 24 h, ROS and MDA content increased, while GSH/GSSH deceased significantly. These experimental results showed that PCP exposure could change CYP450 gene expression and activity, ROS and MDA content, and GSH/GSSH ratioin LMH cells. In this view, multiple evaluation indexes should be used to assess the cell toxicity of PCP, which will provide better understanding for PCP risk assessment and mechanism studies.

Keywords: pentachlorophenol; chicken hepatoma cells; cytochrome 450; sulfotransferase; oxidative stress

五氯酚(pentachlorophenol, PCP)作為氯代烴類殺蟲劑和滅真菌劑，具有低成本優勢，被廣泛地用作農業殺蟲劑、除草劑和木材防腐劑等[1]。PCP因具有穩定的芳香環結構和高氯含量而不容易被降解，已成為重要的環境污染物[2]，PCP污染所造成的環境問題也日益受到全社會的高度重視[3]。PCP可以通過雨水等擴散，從而轉移到水果、蔬菜和谷物中[4]。已有研究表明，PCP在水系統中半衰期長達200 d[5]；PCP在人體內的半衰期為33 h至16 d[6]。PCP對動物體毒性研究表明慢性暴露可造成嚙齒類動物多種不良效應，包括免疫系統損傷等[7-10]。PCP是潛在的致癌物質，在實驗動物中可誘發腫瘤，其氧化脫氯生成的生物大分子在PCP的毒性中具有重要作用[11]。

流行病學研究顯示，職業人群在PCP暴露后增加了患惡性淋巴瘤和白血病的風險[9]。因此開展PCP對生物體的毒理學研究，特別是在細胞水平上利用多個評價指標研究PCP對細胞的毒性效應，對有毒物質的環境風險評價具有重要意義。研究發現PCP可通過解偶聯氧化磷酸化產生細胞毒性[12]。生物體細胞中CYP3A4酶承擔PCP的生物轉化作用，通過產生毒性更強的四氯代氫醌(tetrachlorohydroquinone, TCHQ)而產生細胞毒性[13]。TCHQ是PCP的主要毒性代謝產物，活性氧(ROS)參與了TCHQ的毒性作用。同時PCP的毒性也可能與生成的高反應性代謝物——四氯-1,4-苯醌(tetrachloro-1,4-benzoquinone, TCBQ)有關[14]。作為親電子分子，TCBQ與脫氧鳥苷形成加合物，從而導致細胞遺傳毒性[15]。此外，TCBQ易迅速產生四氯醌(tetrachlorosemiquinone, TCSQ)自由基，并使細胞產生氧化應激。這些研究表明PCP及代謝產物對人和動物細胞具有遺傳毒性和潛在的致癌性。鳥類作為生態系統食物鏈中的頂級生物類群與人類處于相似的食物鏈地位，已經成為監測生態環境中鹵代有機污染物的指示生物[16]，因此本研究開展了PCP對雞肝癌細胞的毒性效應，并初步探討了其毒性機制，為評價PCP環境污染水平和對人群的潛在威脅提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

PCP(CAS號87-86-5，純度97%)和Gelatin購自Sigma-Aldrich(美國)；Waymouth’s MB 752/1培養基(貨號：11220-035)和進口胎牛血清(貨號：10099141)購自Gibco(美國)；H2DCF-DA(Life Technologies，美國)。

1.2 細胞培養

雞肝癌細胞系(chicken hepatoma cells, LMH)(CRL-2117)購自ATCC公司(美國)。在無菌條件下，用0.1% gelatin溶液包被細胞培養瓶。LMH細胞用Waymouth’s MB 752/1培養基和15%進口胎牛血清于37 ℃、5% CO2培養箱進行培養。

1.3 細胞暴露實驗

首先將PCP溶解在二甲基亞砜(DMSO)中，配成200 mmol·L-1PCP母液[12]。然后用含有血清的培養基將PCP母液稀釋成不同的濃度。對照組用含有血清的培養基。將培養瓶中的細胞消化，進行細胞計數，然后在6或96孔板中加入一定的細胞個數。24 h后，可將原有的培養基倒掉，加入含不同PCP濃度的培養基，在培養箱繼續培養。

1.4 細胞活力檢測(MTT法)

設置96孔板中間6×10陣列共60個孔為實驗孔，取100 μL細胞懸液接種于96孔板中，每孔細胞數為3×104。細胞培養4 h后，棄去原有培養基，加入200 μL用培養基稀釋成不同濃度的PCP溶液(0～1 mol·L-1設定濃度梯度)，在培養箱繼續培養。每組設6個平行孔。

在PCP處理細胞24 h后，每孔中加入20 μL現配制的5 g·L-1MTT溶液，放入CO2細胞培養箱中，繼續培養4 h后，棄去培養基，每孔中加入150 μL DMSO，然后在酶標儀中設置程序震蕩5 min，選擇光吸收模式，在570 nm讀取每孔中光吸收值。實驗重復3次。計算細胞抑制率：細胞抑制率(%)=(1﹣實驗組OD平均值/對照組OD平均值)×100%。

1.5 細胞內活性氧(ROS)的測定

將H2DCF-DA配制成10 mmol·L-1的母液，再用waymouth’s MB 752/1培養基(不含血清)將母液稀釋1 000倍，稀釋成10 μmol·L-1的工作液。不同濃度PCP處理LMH細胞方法同前，每組設6個平行孔，重復3次。細胞染毒24 h后在96孔板中加入5 μL H2DCF-DA的工作液，37 ℃條件下反應30 min。每孔加入200 μL不含血清的waymouth’s MB 752/1培養基洗滌LMH細胞3次。在每孔中加入100 μL 1×PBS，檢測反應生成的DCF熒光。

1.6 實時熒光定量PCR

細胞樣品總RNA的提取：6孔板中每孔的LMH細胞約106個，每組設6個平行孔，重復3次。經過不同濃度的PCP暴露后，用TRIzol法提取細胞RNA。

熒光定量PCR檢測目的基因用天根公司試劑盒。定量引物在表1中列出。

1.7 細胞P450酶活性和抗氧化指標的檢測

細胞染毒方法同前，每組設6個平行孔，實驗重復3次。細胞色素P450酶活性(EROD、MROD、PROD、BROD和BFC)用試劑盒(Genmed Scientifics Inc.，美國)檢測。MDA含量和GSH/GSSH比值的測定采用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒。

1.8 數據統計

通過SPSS軟件(SPSS, Inc., 美國)進行數據的統計和分析。統計數據用平均值±標準誤(mean± SD)表示。使用單因素的方差及最小顯著差法(LSD)分析對照組和實驗組間的差異，P< 0.05表示差別具有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 LMH細胞經PCP處理后的細胞活力變化

用不同濃度的PCP處理LMH細胞24 h后，計算出各濃度PCP對細胞的抑制率，采用biphasic濃度效應模型擬合[17]，劑量-效應曲線見圖1。結果顯示LMH細胞經不同濃度PCP暴露24 h后，呈現出先促進細胞增殖后抑制的J-型曲線。MTT實驗結果推導出PCP對LMH的24 h-EC50為427.52 μmol·L-1。

表1 雞肝癌細胞系(LMH)細胞經PCP暴露后熒光定量PCR引物列表Table 1 The primers for genes in chicken hepatoma cells (LMH) exposed to PCP

圖1 不同濃度的PCP處理LMH細胞24 h后 細胞活力變化Fig. 1 MTT assay in LMH cells exposed to PCP for 24 h

LMH細胞在0.4～25 μmol·L-1PCP染毒劑量下，細胞活性未受到影響。100 μmol·L-1PCP使細胞活力增加17%(圖2)。為了研究在不引起LMH細胞活性受到抑制的情況下，低濃度PCP對細胞內酶活性和抗氧化反應的影響，LMH細胞經0.4、1.56、6.25、25和100 μmol·L-1PCP處理后測定細

胞內CYP450酶活性等指標。

2.2 PCP處理LMH細胞CYP450及SULT1s基因表達的變化

經不同濃度PCP暴露24 h的LMH細胞，細胞CYP1A4、CYP1A5、CYP1B1、CYP1C1、CYP3A4和CYP3A37基因表達變化見圖3。其中，25和100 μmol·L-1PCP可引起LMH細胞內CYP1A4表達量升高，CYP1A5在6.5～100 μmol·L-1PCP濃度下較對照組顯著升高，在100 μmol·L-1組升高6.27倍。而CYP1B1基因只在6.5 μmol·L-1PCP暴露組升高，CYP1C1只在25 μmol·L-1PCP暴露組升高。芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AHR)和芳香烴受體核轉運蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)在1.56 μmol·L-1PCP濃度暴露下可被誘導。PCP濃度為0.4～100 μmol·L-1可引起細胞中SULT1B1和SULT1B1表達明顯下降(圖3)。

圖2 不同濃度PCP處理LMH細胞24 h后細胞活力變化Fig. 2 The viability of LMH cells treated with different concentration of PCP for 24 h

圖3 PCP處理LMH細胞24 h后，CYP450及SULT1B基因表達的變化Fig. 3 Effects of PCP on CYP450 and SULT1B mRNA expression in LMH cells

圖4 PCP處理LMH細胞24 h后，CYP450酶活性變化注：乙氧基異酚惡唑脫乙基酶(EROD)，甲氧基異酚惡唑脫甲基酶(MROD)，芐氧基試鹵靈-O-脫烷基化酶(BROD)， 戊氧基異酚惡唑脫甲基酶(PROD)，芐氧基三氟甲基香豆素脫烷基化酶(BFC)。Fig. 4 Effects of PCP on the CYP450 enzyme activities of the LMH cellsNote: ethoxyresorufin O-deethylation (EROD), methoxyresorufin O-demethylation (MROD), benzyloxyresorufin O-debenzylation (BROD), pentoxyresorufin O-depentylation (PROD), benzyloxy-trifluoromethyl-coumarin (BFC).

2.3 PCP處理的LMH細胞CYP450酶活性

LMH細胞暴露于PCP 24 h后，發現1.56、6.25、25、100 μmol·L-1PCP可增加細胞EROD、MROD、PROD和BFC活性，而并未引起LMH細胞BROD酶活性的變化(圖4)。其中，100 μmol·L-1PCP對LMH細胞中的EROD、MROD和PROD酶活性的促進作用最顯著。

2.4 LMH細胞對PCP處理的氧化應激響應

LMH細胞暴露于PCP 24 h后，發現6.25、25、100 μmol·L-1PCP可誘導細胞ROS升高，在100 μmol·L-1PCP作用下，ROS可升高23%。GSH/GSSH在1.56～100 μmol·L-1PCP作用下顯著降低，其中100 μmol·L-1PCP可使GSH/GSSH比值下降45%，同時，1.56～100 μmol·L-1PCP可以增加LMH細胞內MDA的含量(圖5)。

3 討論(Discussion)

本研究中PCP對雞肝癌細胞(LMH)活性影響表現為低濃度0.4～25 μmol·L-1PCP對細胞活性無影響，100 μmol·L-1PCP使LMH細胞增殖，高濃度PCP明顯抑制LMH生長。AML12小鼠正常肝細胞經PCP染毒后，MTT結果也顯示0～3.87 μg·mL-1PCP促進AML12細胞增殖，7.75～31.0 μg·mL-1PCP對AML12細胞出現明顯抑制效應[18]。已有研究結果表明PCP暴露對不同類型細胞的生長影響表現出差異性[19]。本研究中PCP對LMH細胞24 h的半數效應濃度24 h-EC50為427.52 μmol·L-1，而PCP對人肝癌細胞系HepG2(human liver carcinoma cell)細胞24 h-EC50為(23.0 ± 5.6) μg·L-1[20]，PCP對人宮頸癌細胞的24 h-EC50為66.59 mmol·L-1[21]，說明與雞肝癌細胞相比，人肝癌細胞對PCP更敏感。

細胞色素P450(CYPs)是含有血紅素結合位點的蛋白家族。由于它們參與多種內源和外源物質的代謝，在生物體內發揮重要的作用[22]。不同的藥物和其他外源化合物對生物體CYPs的表達和酶活性影響不同[23]。在眾多CYPs中，CYP1A家族是有機污染物轉化中發揮主要作用的亞族[24]。PCP可引起HepG2細胞CYP1A1表達升高[20]，在LMH細胞中也發現25 μmol·L-1和6.5 μmol·L-1PCP可分別誘導CYP1A4和CYP1A5的表達。CYP1A基因通過外源物質與芳香烴受體(AHR)結合進而使芳香烴受體核轉運蛋白(ARNT)與特定的DNA識別位點結合而被誘導表達[25]。激活的AHR/ARNT復合物識別位位于基因啟動子區的外源性反應元件序列(XRE)，進而調控下游基因表達，如CYP1A1和UGTA1酶等[26]。本研究中PCP可顯著誘導LMH細胞中AHR和ARNT的表達，進而通過AHR通路誘導其調控基因CYP1A的表達。已有文獻表明PCP在生物體內通過形成二聚物導致四氯二苯-p-二噁英(TCDD)生成，而TCDD可以結合AHR誘導CYP1A[27]。本研究中LMH細胞中CYP1B1和CYP1C1分別在6.25和25 μmol·L-1PCP作用下表達水平升高，說明PCP是CYP1B1和CYP1C1的誘導劑。細胞色素P450單加氧酶3A4(CYP3A4)可代謝多種外源物質，體外暴露實驗表明PCP可誘導小鼠肝細胞CYP3A4表達[28]，在LMH細胞中也發現6.25～100 μmol·L-1PCP可誘導CYP3A4表達。由于CYP450對外源物質有解毒作用，CYP450基因表達的改變可減輕有毒物質發揮毒性作用[29]。

圖5 PCP處理LMH細胞24 h后其氧化應激反應的測定Fig. 5 Effects of PCP on the ROS of the LMH cells

EROD、MROD、BROD和PROD是重要的CYP450酶，在外源化學品解毒中發揮重要作用[30-31]。目前，對外源性物質的代謝研究中，CYP450基因表達的誘導或抑制已經成為生態毒理學和環境污染生物監測的一個有效手段[32-34]。本研究中1.25 μmol·L-1PCP可使細胞EROD、MROD、PROD和BFC活性增加。這表明PCP可改變不同CYP450的酶活性，CYP450酶活性可成為PCP污染監測的指標之一。這些結果說明雖然低濃度PCP未對細胞活性抑制，但細胞內CYP450活性增加，低濃度PCP可通過激活CYP450酶活性而使細胞免受損傷。

生物體內發生的硫酸化反應與環境污染物、致癌物質、激素等各種內源性和外源性化合物的活化及解毒作用有關[35]。硫酸基轉移酶(SULTs)可催化從3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)轉移SO3-至親核受體底物而發揮生物轉化作用[36]。大量研究表明PCP是SULTs的抑制劑[37-39]，如小鼠SULT1C1活性可被PCP抑制[40]。SULT1B1與脂質代謝有關，芯片的數據顯示，SULT1B1在生長快速的雞肝組織中比生長慢的雞肝臟組織中表達量高7倍[41]。已有數據顯示雞SULT1C1酶與小鼠SULT1C1結構類似，表明鳥類及哺乳類硫酸基轉移酶在結構和功能上是相似的[42]。本研究中發現0.4～100 μmol·L-1PCP暴露可引起LMH細胞SULT1B1和SULT1C1的表達降低，但在此濃度下細胞活性有增強，說明PCP在細胞內通過硫酸基轉移酶發生生物轉化，減少了PCP對細胞的毒性作用。

活性氧(ROS)通常是線粒體能量代謝的產物，與細胞生長、細胞信號傳導和內環境穩定有關[43]。持續升高的ROS水平是腫瘤發生、腫瘤生長和腫瘤轉移的特征現象[44]。LMH細胞經低濃度PCP暴露后可引起細胞內ROS升高，同時引起GSH/GSSG比值下降和MDA含量增加，說明PCP也可引起細胞內氧化應激反應，這與白腰文鳥體內暴露實驗的結果一致[45]。

本論文中雞肝癌細胞(LMH)經6.25～100 μmol·L-1PCP染毒后細胞內ROS及MDA含量升高，進而造成機體發生氧化應激反應，同時PCP影響CYP450基因及激活AHR1表達，表明PCP可通過AHR1與ARNT1通路作用于CYP1A基因。此外，PCP在LMH細胞內還參與硫酸基轉移酶的生物轉化作用。用離體培養的細胞來評價環境中化學物質的毒性作用，是近年來生物和環境相關領域研究的熱點之一。本文從細胞、蛋白質和基因水平上分析了PCP對細胞的毒性作用，對PCP環境風險評價具有重要意義。

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TheToxicityandMechanismofPentachlorophenolExposureonChickenHepatomaCells

Jiang Peng, Sheng Nan, Wang Jianshe, Dai Jiayin*

Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Key Laboratory of Animal Ecology and Conservation Biology of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

2016-12-12錄用日期2017-2-10

1673-5897(2017)3-373-09

X171.5

A

戴家銀(1965—)，男，博士，研究員，主要從事持久性污染物的生態毒理學研究工作，發表學術論文100余篇。

廣東省自然科學基金(2015A030312005)

蔣鵬(1981-)，女，博士，研究方向為生態毒理學，E-mail: jiangpeng169@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: daijy@ioz.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20161212001

蔣鵬, 盛南, 王建設, 等. 五氯酚(PCP)對雞肝癌細胞(LMH)毒性效應的機制研究[J]. 生態毒理學報，2017, 12(3): 373-381

Jiang P, Sheng N, Wang J S, et al. The toxicity and mechanism of pentachlorophenol exposure on chicken hepatoma cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 373-381 (in Chinese)