赤霉酸暴露對SD大鼠青春期發育的影響

王小燕，陳靜，柏丁丁，程微波，黃毅娜,*

1. 四川大學華西公共衛生學院，成都 6100002. 四川省農業廳安全中心，成都 610000

赤霉酸暴露對SD大鼠青春期發育的影響

王小燕1，陳靜2，柏丁丁1，程微波1，黃毅娜1,*

1. 四川大學華西公共衛生學院，成都 6100002. 四川省農業廳安全中心，成都 610000

赤霉酸是目前國內外使用極其廣泛的一種植物生長調節劑，但是針對其發育毒性的數據依然較少。本文探討了赤霉酸暴露對SD大鼠青春期發育的影響。參考國內外環境內分泌干擾物危害的評價方法，將144只初斷乳SD大鼠按體重隨機分為4組，分別為對照組和1、10、100 mg·kg-1bw劑量組，采用經口灌胃方式對雄鼠連續染毒28 d，雌鼠連續染毒21 d。暴露結束后檢測大鼠的體重、食物利用率、雄鼠包皮分離時間/雌鼠陰道開口時間、血清生化指標、臟器系數及組織病理學的變化。研究結果表明，與對照組相比，僅10和100 mg·kg-1bw劑量組雄鼠的肌酐水平顯著升高(P<0.01)，100 mg·kg-1bw劑量組雌鼠谷丙轉氨酶水平有顯著升高(P<0.01)。而與對照組相比，所有劑量組均未觀察到大鼠的體重、食物利用率、雄鼠包皮分離時間/雌鼠陰道開口時間、臟器系數等指標有顯著性差異的改變(P>0.05)，組織病理學結果亦顯示大鼠重要器官無損害性改變。因此，在本試驗給予的劑量范圍內赤霉酸染毒不會對SD大鼠青春期發育產生顯著影響。

赤霉酸；SD大鼠；發育毒性

Received19 July 2016accepted4 December 2016

Abstract: Although gibberellic acid has been widely used as a plant growth regulator worldwide, the researches on the developmental toxicity remain still limited. The present study therefore investigated the influence of gibberellic acid exposure on the pubertal development of SD rats. Based on the evaluation methods of the hazards of environmental endocrine disrupting chemicals, 144 weanling SD rats were randomly divided into four groups by weight. The rats were given 0, 1, 10, 100 mg·kg-1bw dosage of gibberellic acid in distilled water through gavage, respectively, and the treatments were conducted every day to male rats for 28 d and to female rats for 21 d. In the end of the exposure, the data of the rats’ weights, the food utilization rates, the foreskin separation time of male rats/the vaginal opening time of female rats, the serum biochemical indicators, the viscera coefficients and the histopathological changes were collected. The results showed that the levels of the creatinine significantly increased in the male rats with an addition of 10 or 100 mg·kg-1bw of gibberellic acid when compared with the control group (P < 0.01). Meanwhile, the ALT levels significantly increased (P < 0.01) in 100 mg·kg-1bw gibberellic acid treated female rats. On the other hand, no significant differences of the rats' weight, the food utilization rates, the foreskin separation time of male rats/the vaginal opening time of female rats and the viscera coefficients in all exposure doses groups were observed when compared with the control groups (P > 0.05). Moreover, the histopathological results showed that vital organs of all of the rats were normal. Hence, it was suggested that gibberellic acid in the present experimental dose range might not lead to a remarkable influence on the puberty of SD rats.Keywords: gibberellic acid; SD rats; developmental toxicity

赤霉酸，又名920，分子式為C19H22O6，其分子結構與體內類固醇激素相似，具有誘導無子果實的形成、提高座果率、改善果實品質、防止落花落果、促進果實早熟、延遲果樹花期、增加果品貯藏能力、打破休眠等調控作用[1]。基于具有眾多的生理學功能，赤霉酸已經成為了國內外使用極其廣泛的一種植物生長調節劑，在培育植物抗逆新品種及提高農作物產量等方面發揮重要作用。

赤霉酸被認為是最安全的生長調節劑之一，動物急性毒性試驗基本無毒性反應[2]，但對大鼠進行赤霉酸亞慢性染毒后，動物出現了心臟、腎臟、脾等器官中的超氧化物歧化酶上升，提示了氧化損傷的存在[3-4]。對赤霉酸安全性研究[5-6]顯示，赤霉酸具有一定的發育毒性、致畸作用和致癌效應。湛進等[7]研究顯示，赤霉酸具有促進仔鼠出生后生長發育的作用。但關嵐等[8]研究發現，赤霉酸對SD雌鼠的生長發育沒有明顯的影響。目前，有關赤霉酸的內分泌干擾作用仍存在爭議。本文參考美國EPA的內分泌干擾物甄別標準程序，初步探討了暴露赤霉酸對初斷乳大鼠青春期發育的影響，為評價其內分泌干擾毒性提供基礎數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品

赤霉酸，購于四川龍蟒福生科技有限責任公司，純度為90%，試驗時樣品采用蒸餾水配制和稀釋。

1.2 實驗動物及飼養

選擇初斷乳(出生后21 d)的SPF級SD大鼠144只，雌雄各半，體重為45～48 g，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(川)2013-19。實驗動物在四川大學華西公共衛生學院實驗動物中心屏障級(IVC)動物房[許可證號：四川省實驗動物管理委員會SYXK(川)2013-011號]內飼養，室溫為20～22 ℃，相對濕度為45%～70%。實驗過程中，動物可自由攝食、飲水。

1.3 主要儀器與試劑

超凈生物工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，AU-400型全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司)，酶標儀(MK3，美國熱電公司)，電子天平(BSA223S，德國賽多利斯公司)等。大鼠促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺激素(T4)和睪酮(TESTO)ELISA 試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)。

1.4 試驗方法

將144只初斷乳的SPF級SD大鼠按體重隨機分為對照組和1、10、100 mg·kg-1bw赤霉酸染毒組，每組36只，雌雄各半。于每天上午10:00動物空腹時，采用經口灌胃方式進行染毒，染毒容積為5 mL·kg-1，雄鼠連續染毒28 d，雌鼠連續染毒21 d。實驗期間，每天稱量大鼠體重，并檢查雄鼠包皮分離情況和雌鼠陰道開口情況。

雄鼠第28天/雌鼠第21天染毒灌胃2 h后處死，取血清用全自動生化分析儀測肝功、腎功，酶聯免疫吸附劑測定法(ELISA法)測定TSH、T4、TESTO含量，迅速分離甲狀腺、肝、腎上腺、垂體、睪丸，稱重并計算臟器系數(臟器系數=臟器濕重/空腹體重×100%)。取甲狀腺、肝、腎上腺、垂體、腎、睪丸、卵巢等組織用10%甲醛固定后進行組織病理學觀察。

1.5 實驗數據統計

所有數據先經 Excel 整理后用SPSS19.0軟件進行統計學分析，多組比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One-Way ANOVA)。進一步進行組間兩兩比較時，若方差齊，采用Dunnett-t檢驗；若方差不齊，采用Games-Howell檢驗。以P<0.05為差異有顯著統計學意義。

2 結果 (Results)

2.1 一般情況

在實驗期間，對照組和3個劑量組大鼠的攝食、飲水、大小便正常，生長發育情況和一般表現良好，未觀察到明顯行為改變和中毒表現。僅10 mg·kg-1bw劑量組有1只雄鼠顯示生長發育遲緩，體重減輕，且在實驗開始的第7天打斗致死，經解剖未發現異樣。

2.2 赤霉酸對大鼠體重和食物利用率的影響

各組大鼠在整個實驗期間的體重和食物利用率結果見表1和表2。由表1和表2可見，相比于對照組，各劑量組大鼠的體重及食物利用率差異均無統計學意義(P>0.05)，表明赤霉酸染毒對SD大鼠的體重和食物利用率無明顯影響。

表1 赤霉酸對SD大鼠體重的影響Table 1 The effect of gibberellic acid on body weight of SD rats ( ±S)

注：體重單位為g。

Note: the unit of body weight is g.

表2 赤霉酸對SD大鼠食物利用率的影響Table 2 The effect of gibberellic acid on food utilization rate of SD rats (±S)

表3 赤霉酸對雄鼠包皮分離/雌鼠陰道開口時間的影響Table 3 The effect of gibberellic acid on foreskin separation time of male rats and vaginal opening time of female rats (±S)

2.3 赤霉酸對雄鼠包皮分離/雌鼠陰道開口時間的影響

不同劑量赤霉酸對雄鼠包皮分離/雌鼠陰道開口時間的影響見表3。由表3可見，各劑量組雄鼠的包皮分離時間/雌鼠的陰道開口時間與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.4 赤霉酸對大鼠血清中T4、TSH、TESTO含量的影響

不同劑量赤霉酸對大鼠血清中T4、TSH、TESTO含量的影響見表4。由表4可見，各劑量組T4、TSH、TESTO水平與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

表4 赤霉酸對SD大鼠血清中T4、TSH、TESTO含量的影響Table 4 The effect of gibberellic acid on T4，TSH， TESTO in serum of SD rats (±S)

2.5 赤霉酸對大鼠生化指標的影響

不同劑量赤霉酸對大鼠血液生化指標的影響見表5。由表5可見，10、100 mg·kg-1bw劑量組雄鼠肌酐(CREA)水平顯著高于對照組(P<0.01)；100 mg·kg-1bw劑量組雌鼠谷丙轉氨酶(ALT)水平顯著高于對照組(P<0.01)；赤霉酸各劑量組的其余生化指標與對照組比較，均無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 赤霉酸對大鼠臟器系數的影響

不同劑量赤霉酸對大鼠臟器系數的影響見表6和表7。由表6和表7可見，各劑量組大鼠的臟器重量以及臟器系數與對照組相比，均無顯著性差異(P>0.05)。

表5 赤霉酸對SD大鼠血清生化指標的影響Table 5 The effect of gibberellic acid on serum biochemical indicators of SD rats (± S)

注： ALT是谷丙轉氨酶，AST為谷草轉氨酶，TP為總蛋白，ALB為白蛋白，BUN為尿素氮，CREA為肌酐，CHO為膽固醇。**與陰性對照比較 有顯著性差異(P<0.01)。

Note: ALT for alanine aminotransferase, AST for aspartate aminotransferase, TP for total protein , ALB for albumin, BUN for blood urea nitrogen, CREA for creatinine, CHO for cholesterol. Compared with the control group,**, P < 0.01.

表6 赤霉酸對SD雄鼠臟器重量(g)及系數(%)的影響Table 6 The effect of gibberellic acid on viscera weight (g) and coefficient (%) of SD male rats (±S)

表7 赤霉酸對SD雌鼠臟器重量(g)及系數(%)的影響Table 7 The effect of gibberellic acid on viscera weight (g) and coefficient (%) of SD female rats (±S)

2.7 組織病理學檢測結果

雄鼠各劑量組中除發現極個別動物存在肝糖原蓄積、腎局灶間質纖維化外，其余組織病理學觀察均未見明顯異常。雌鼠各劑量組中除發現極個別受檢動物肝糖原蓄積、慢性腎盂炎外，其余組織病理學觀察也均未見明顯異常。上述組織雖出現某種病變，但發生例數甚少，且對照組也時有發生，不具規律性。因此，這些臟器的病變屬于動物自發性病變，與赤霉酸染毒無關。附雄鼠睪丸、雌鼠卵巢的組織病理圖片，見圖1～4。

3 討論(Discussion)

全球性人群研究提示兒童青春期發育有提前趨勢，而環境內分泌干擾物(EDCs)可通過發揮擬/抗雌激素、擬/抗雄激素效應或直接作用于垂體-下丘腦-性腺軸從而影響青春期發育[9]。赤霉酸，作為一種環境雌激素，具有眾多的生理學功能，已成為目前國內外使用極其廣泛的一種植物生長調節劑。但其對人群青春期發育的影響尚存在爭議。

本文通過給予剛斷乳的SD大鼠赤霉酸，探討赤霉酸對大鼠青春期發育的干擾效應，為赤霉酸的安全性應用提供依據。本試驗研究結果發現，各劑量組大鼠的生長狀況都表現良好，相比于對照組，各劑量組大鼠的體重、食物利用率、臟器系數等指標并無明顯變化。試驗中觀察的雄鼠包皮分離時間和雌鼠陰道開口時間是觀察外源化合物干擾青春期發育的可靠指標[10-11]，雄鼠包皮分離、雌鼠陰道開口標志大鼠進入青春期階段。本試驗研究結果顯示，各劑量組雄鼠包皮分離時間和雌鼠陰道開口時間與對照組相比差異均無統計學意義，雄鼠睪丸和雌鼠卵巢的病理結果也均未見異常，說明在本試驗給予的劑量范圍內，赤霉酸不會影響大鼠的青春期啟動時間，對生殖器官也無明顯影響。雖然與對照組相比，10和100 mg·kg-1bw劑量組雄鼠的CREA水平顯著升高，100 mg·kg-1bw劑量組雌鼠ALT水平顯著升高，但其水平仍在正常參考值范圍內[12]，且組織病理學檢查均未發現異常，可能與代謝攪動有關，并沒有生物學意義，更無毒理學意義。綜合上述各項生物學指標的結果表明，在本試驗給予的劑量范圍內赤霉酸染毒不會對SD大鼠青春期發育產生顯著影響。

圖1 對照組雄鼠睪丸 (HE染色，×100)Fig. 1 Testes of male rat in the control group (HE staining, ×100)

圖2 100 mg·kg-1 bw劑量組雄鼠睪丸(HE染色，×100)Fig. 2 Testes of male rat in the 100 mg·kg-1 bw dosage group (HE staining, ×100)

圖3 對照組雌鼠卵巢(HE染色，×100)Fig. 3 Ovary of female rat in the control group (HE staining, ×100)

圖4 100 mg·kg-1 bw劑量組雌鼠卵巢(HE染色，×100)Fig. 4 Ovary of female rat in 100 mg·kg-1 bw dosage group (HE staining, ×100)

目前，美國食品中農藥殘留限量標準和日本農產品農藥殘留限量標準規定水果和蔬菜中赤霉酸的最高殘留限量為0.2 mg·kg-1，而我國目前還未出臺相應的農產品限量標準。本試驗中給予大鼠赤霉酸最高劑量為100 mg·kg-1bw，高達兒童可能攝入的4×104倍。兒童年齡2～10歲，平均體重17.6 kg，平均每日果蔬消費量約215.8 g，假設我國果蔬中赤霉酸的最高殘留量約為0.2 mg·kg-1，估算出兒童平均每日可能最高攝入赤霉酸0.0025 mg·kg-1bw，沒有發現對大鼠青春期發育有不良影響，充分說明該限量標準的安全性，我國亦可以借鑒，以填補我國赤霉酸殘留限量為零的空白。

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◆

TheInfluenceofGibberellicAcidExposureonthePubertalDevelopmentofSDRats

Wang Xiaoyan1, Chen Jing2, Bai Dingding1, Cheng Weibo1, Huang Yina1,*

1. Sichuan University West China School of Public Health, Chengdu 610000, China2. Sichuan Provincial Agricultural Department of Security Center, Chengdu 610000, China

10.7524/AJE.1673-5897.20160719001

2016-07-19錄用日期2016-12-04

1673-5897(2017)3-652-06

X171.5

A

黃毅娜(1976-)，女，博士，副教授，研究方向為衛生毒理學。

王小燕(1991-)，女，在讀研究生，研究方向為食品毒理學，E-mail：xiaoyanwang105@foxmail.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: m18483636173@163.com

王小燕, 陳靜, 柏丁丁, 等. 赤霉酸暴露對SD大鼠青春期發育的影響[J]. 生態毒理學報，2017, 12(3): 652-657

Wang X Y, Chen J, Bai D D, et al. The influence of gibberellic acid exposure on the pubertal development of SD rats [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 652-657 (in Chinese)