鄰苯二甲酸酯類雌激素活性聯合作用模型分析

何穎，張暉,*，甄士琪，張麗娟，曹馳程，章奇

1. 東南大學公共衛生學院 環境醫學工程教育部重點實驗室，南京 2100092. 江蘇省疾病預防控制中心食品安全與評價所，南京 210009

鄰苯二甲酸酯類雌激素活性聯合作用模型分析

何穎1，張暉1,*，甄士琪2，張麗娟1，曹馳程1，章奇1

1. 東南大學公共衛生學院 環境醫學工程教育部重點實驗室，南京 2100092. 江蘇省疾病預防控制中心食品安全與評價所，南京 210009

環境雌激素對生命健康影響受到廣泛關注，現行污染物環境標準制訂和風險評價只針對單一化合物而非混合物效應，不足以保護生命安全與人類健康。為探討環境雌激素的混合物效應，選擇對雌激素敏感的人乳腺癌MCF-7細胞增殖實驗，檢測雌二醇(E2)、鄰苯二甲酸酯類化合物(DBP和DEHP)的單一及其聯合雌激素活性；基于單一化合物的濃度-反應曲線，運用濃度相加(CA)和獨立作用(IA)模型對混合物的毒性進行預測，并將模型預測結果與混合物實驗數據進行比較分析。結果表明，E2、DBP、DEHP對MCF-7細胞的單一作用數據可通過Weibull方程擬合，由擬合方程得到的半數效應濃度(EC50)及95%置信區間分別為3.450×10-6(2.373×10-6～1.675×10-5)、5.138(1.489～1.082×10)、1.186(4.478×10-1～2.24) μmol·L-1；3種化合物的混合物數據亦可通過Weibull、Logistic和ExpGro1方程進行有效擬合，混合物效應與化合物單獨作用產生的效應具有顯著性差異；3種化合物表現非相似聯合作用，利用獨立作用(IA)模型預測混合物效應較為可靠，外源性環境雌激素與內源性雌激素聯合作用產生的混合效應顯著。環境雌激素混合物毒性可以通過相加作用模型預測，為環境復合污染的風險評價和管理提供基礎數據。

鄰苯二甲酸酯類；MCF-7細胞；雌激素活性；聯合作用

Received22 April 2017accepted31 May 2017

Abstract: Estrogens in the environment have received extensive concerns due to their potential risks to human health. The present environmental standards and risk assessment procedures have limitation in the protection of human health and safety, because they are on the basis of the single effects of chemical compounds, rather than the combined effects. To investigate the combined effects of estrogens, the single and joint toxicities of three estrogens, including estradiol (E2) and phthalic acid ester compounds (DBP and DEHP), were investigated using the estrogen-sensitive MCF-7 human breast cancer cells proliferation assay. The individual concentration-response curves of the three estrogens were applied to predict the joint toxicity of their mixtures according to the concentration addition (CA) and the independent action (IA) models. The predicted concentration-response curves were further compared with the experimental data. The results showed that the single effects of E2, DBP, and DEHP were well fitted by Weibull equation, and their EC50(95% confidence interval) values were 3.450×10-6(2.373×10-6-1.675×10-5) μmol·L-1, 5.138 (1.489-10.820) μmol·L-1, and 1.186 (0.448-2.240) μmol·L-1, respectively. The effect from the mixtures of the three estrogens were well described by Weibull, Logistic, and ExpGro1 equations, while significant differences were observed between the single effects of the three estrogens and the combined effects of their mixtures. The three compounds showed dissimilar joint actions, and the IA model was more appropriate to predict the combined effects compared to the CA model. The combined effects of exogenous environmental estrogen and endogenous estrogen were significant. Overall, the toxicity of estrogens mixtures can be predicted by the additive model, providing the basic data for the risk assessment and management of combined pollution in the environment.

Keywords: phthalates; MCF-7 cells; estrogenic activity; combination effects

鄰苯二甲酸酯類(phthalic acid esters, PAEs)化合物是一種增塑劑，主要包括：鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(diisononyl phthalate, DINP)等，被廣泛應用于塑料容器、食品包裝和個人護理用品等數百種產品中[1-2]。研究報道，增塑劑為環境內分泌干擾物，與生殖障礙、出生缺陷、發育異常和代謝紊亂有關[3]。現實生活中，機體總是同時或相繼暴露于多種環境污染物，特別是環境雌激素的濃度-反應關系非線性，往往呈現低劑量效應，彼此間表現各種聯合作用[4]。現行只對單一化合物而非混合物效應進行的評價，可能不足以保護生物安全和人類健康，需要研究混合物效應評價和預測方法[5-7]。

化合物相互作用分為無交互作用和有交互作用2種情況，無交互作用就是我們通常定義的“相加作用”類型，相加作用是聯合作用定量分析的前提和基礎，有Loewe相似作用和Bliss獨立作用[8-10]，前者表示聯用化合物作用機理相似，有對數劑量-概率單位平行，聯用效應相當于同一物質的幾個不同劑量合用，即濃度相加(concentration addition, CA)；而后者指聯用化合物作用機理不同，即獨立作用或反應相加(independent action or response addition, IA)。在藥理學和數理統計學基礎上可推導出二類數學模型：濃度相加模型(concentration addition, CA)和反應相加模型(independent action or response addition, IA)。濃度相加適用于相似聯合作用，從“毒性單位”的概念出發；反應相加模型適用于獨立聯合作用，根據概率論中“獨立事件的概率相加公式”推導而來，適合于作用機理不同的幾種化合物的相加計算。實際情況下我們往往不能夠準確判斷相加作用的類型，所以，在評價時，需要同時應用2類模型綜合分析評價。如果混合物實際測得的效應與模型預測結果相一致，則分別為模型所定義的相加作用類型。

本文通過雌激素依賴型人乳腺癌MCF-7細胞體外增殖實驗(E-screen assay)，對PAEs的聯合作用進行研究，先建立單個化合物雌激素活性效應數據庫，在對單個化合物濃度-反應關系進行非線性回歸分析的基礎上，應用2類相加作用數學模型，預測PAEs混合物的生物效應，并與實際測得的混合物效應結果比較，進而有助于判斷該類化合物聯合作用類型，同時測試了模型的預測效力和實用性，為化合物聯合作用的預測提供理論依據和實用方法。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 測試化合物

3個受試化合物為：17β-雌二醇(17β-estradiol，E2，CAS:50-28-2)，純度≥98%，分子式C18H24O2，分子量272.38，購自美國Sigma公司；鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate，DEHP，CAS:117-81-7)分子式C24H38O4，分子量390.56，標準品，購于美國AccuStandard公司；鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP，CAS:84-72-2)，分子式C16H22O4，分子量278.34，標準品，購于美國AccuStandard公司。

1.1.2 試劑與儀器

用于細胞培養的DMEM高糖培養基、無酚紅DMEM培養基、胰酶和胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司。

儀器包括超凈工作臺(BSG-1500ⅡA2-X，濟南鑫貝西生物技術有限公司)、CO2培養箱(Series 8000WJ, Thermo Scientific, USA)，倒置顯微鏡(IX2-ILL30, Olympus, Japan)，酶聯免疫檢測儀(Epoch, BioTek instruments, Tnc., USA)等。

1.2 MCF-7細胞增殖實驗(E-screen assay)

經雌激素受體ERα基因表達實驗證實本實驗選用的MCF-7細胞為ERα陽性的雌激素依賴型細胞，這也進一步驗證了細胞增殖實驗結果的敏感性和可靠性。

采用MTT作為顯色底物進行細胞增殖實驗[11]，MTT全稱3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，化學名為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，又稱噻唑藍，是一種接受氫離子的黃色染料。具體實驗步驟如下：MCF-7細胞復蘇后用10% FBS高糖DMEM培養基，于5% CO2、37 ℃條件下正常培養至3代以上。實驗前48 h將原培養基替換為含5% CDT-FBS的無酚紅高糖DMEM培養液。收集細胞，調整細胞懸液濃度，以每孔200 μL約6 000～7 000個細胞接種于96孔板中。繼續培養至細胞貼壁后吸去舊培養液，加入200 μL無酚紅培養基配制的不同濃度梯度的化合物或混合物，每個濃度均設置5個復孔。培養48 h后，棄去原有培養基，加入5 mg·mL-1MTT和無血清無酚紅DMEM培養基混合液200 μL，繼續培養3～4 h。1 mL注射器吸去孔內的培養液，每孔加入150 μL DMSO，充分溶解紫色結晶物。選擇490 nm波長，用酶聯免疫檢測儀測定各孔的光密度(OD)值。

以體積分數為0.1%的DMSO為溶劑對照，濃度為1 nmol·L-1的E2作為陽性對照，結果用校正相對增殖效應(relativistic proliferation effect, RPE)表示，RPE=(實驗組OD值-溶劑對照組OD值)/(陽性對照組OD值-溶劑對照組OD值)×100%。

1.3 混合物效應預測模型

根據單一化合物的數據擬合濃度-反應曲線，運用濃度相加(CA)和獨立作用(IA)模型對混合物的聯合毒性進行預測[12-13]。

濃度相加(CA)模型用下式表示：

式中：pi為混合物中化合物i的濃度占總濃度的分數；ECxmix(單位：μmol·L-1)為引起x效應的混合物預測總濃度；其中ECxi(單位：μmol·L-1)可通過單個化合物劑量-反應回歸方程的反函數求得，即：

獨立作用(IA)模型如下：

式中：Eci為混合物中各化學物在ci濃度時所產生的效應，可通過劑量-反應關系方程或內插法計算得到，即：

式中：Fi為單個化學物i的劑量-效應函數，對于給定混合物效應x可通過迭代算法計算。

1.4 數據統計學分析

采用SPSS19.0軟件和Excel軟件對實驗結果進行統計學分析和計算[14-15]。濃度-反應關系采用origin7.5軟件進行非線性曲線擬合，選擇擬合相關決定系數R2值最大的方程為最優擬合方程，同時繪制濃度與細胞相對增殖效應的關系曲線。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 化合物對MCF-7細胞增殖效應影響的實驗結果

(1)單個化合物

在預試驗基礎上確定了3個化合物作用濃度范圍，實驗結果經計算得出各化合物對MCF-7細胞的相對增殖效應(RPE)，表明3個化合物均能促進MCF-7細胞增殖，在設定濃度范圍內呈正相關關系。由圖1可知，17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)濃度在0.01 pmol·L-1～1 nmol·L-1范圍內，細胞相對增殖效應逐漸增大；濃度在1 nmol·L-1時達最大，表明E2在此濃度下雌激素活性最強。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)的濃度-反應關系亦是正相關關系，隨著濃度的增加，增殖效應逐漸增大，DBP在100 μmol·L-1，DEHP在10 μmol·L-1，細胞增殖效應最大。

運用非線性回歸方法對實驗測得的濃度-反應數據進行非線性曲線擬合，并將多個函數擬合的曲線進行比較，獲取擬合度最優的濃度-反應方程，見表1。對比多次擬合結果后發現，E2、DEHP、DBP均是Weibull函數擬合效果最優，說明Weibull函數能夠有效表述這3種化合物對MCF-7細胞增殖影響的濃度-反應關系。根據曲線方程及其反函數方程，計算得出各個化合物單一作用于MCF-7細胞的效應濃度(EC50)值。具體的擬合結果(各化合物擬合方程及其參數、決定系數R2值，以及EC50及其95%置信區間(95%CI)見表2，擬合的曲線如圖1，將3種化合物的濃度-反應曲線整合在同一坐標系中，可清楚地展示各化合物作用的濃度范圍。結合表2和圖1中各曲線的位置分布可知，E2的濃度-反應曲線位于最左側，相對增殖效應最大，EC50為3.450 pmol·L-1；DEHP(EC50=1.186 μmol·L-1)和DBP(EC50=5.138 μmol·L-1)的促增殖能力比E2低105-106倍。這3種化合物對MCF-7細胞的增殖效應為E2 >DEHP>DBP。

(2)混合物

E2、DEHP和DBP等效應固定濃度比混合，即初始混合物按照每種化合物的等效應濃度(如EC50)比例進行混合。構成3種二元混合物E2/DEHP、E2/DBP、DEHP/DBP和1個三元混合物E2/DEHP/DBP，將4個混合物當作4個新的化合物進行實驗。將初始混合物依次稀釋成初始濃度的100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%倍，混合物中每種化合物所占的組成比例始終保持一致。

將混合物對MCF-7細胞增殖影響的實驗結果進行非線性回歸分析，濃度-反應關系擬合模型、參數及對應的R2值見表2，擬合曲線如圖2。四參數的Logistic模型對DEHP/DBP的濃度-反應曲線擬合效果最好，決定系數R2=0.995；E2/DEHP和E2/DBP擬合度最優的模型分別為三參數的ExpGro1方程，R2分別為0.977和0.949；E2/DEHP/DBP擬合度最優的模型為二參數Weibull方程，R2為0.996，方程參數及EC50值見表2。從圖2中各條曲線的分布不難看出，等效應固定濃度比二元混合物的擬合曲線和95%置信區間均介于單個化合物之間，混合物的EC50也都介于單個化合物之間；混合物實驗數據擬合曲線形狀不同于單獨作用的擬合曲線，化合物單獨作用的效應和產生的混合物效應顯著不同；外源化合物單獨作用下在較低濃度時產生的效應較弱，但聯合作用下會產生顯著的混合物效應。

圖1 單一化合物濃度-反應曲線Fig. 1 Concentration-response fitting curves for each of the individual chemical

表1 擬合度最優模型方程及其反函數方程Table 1 The best-fit regression models and its inverse function

圖2 各種混合物聯合作用濃度-反應曲線Fig. 2 Concentration-response fitting curves for each of the mixtures

表2 單一化合物和混合物濃度-反應關系曲線方程參數和EC50(95%CI)Table 2 The corresponding best-fit models with estimated parameters, and the estimated EC50 values and the 95% confidence intervals

圖3 各種混合物實驗結果與相加作用模型預測結果比較Fig. 3 Comparison between the observed and addition models predicted mixture effects

2.2 混合物實驗結果與相加作用模型預測結果的比較

根據17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)單獨作用的濃度-反應回歸方程，應用濃度相加(CA)和獨立作用(IA)模型對這3種化合物的等毒性固定濃度比例混合物效應進行預測，以單個化合物最優化非線性回歸方程為基礎，分別計算從1%到99%的35個效應點在滿足CA和IA模型條件下的混合物效應濃度。將混合物實驗數據擬合的曲線及95%置信限，與CA和IA模型預測曲線畫在一張圖中進行比較，如圖3，可知：4個混合物應用IA模型預測出的混合物效應基本上能夠落在混合物實測效應的95%置信區間內，CA模型得出的效應濃度值偏高，提示此3種化合物聯合作用應用IA模型預測，CA模型會低估混合物效應，證明了3種化合物在本實驗中呈現獨立聯合作用。3種化合物在較低暴露濃度(1/20 EC50)下，單獨存在產生的效應以及聯合存在時產生的混合物效應結果如圖4，表明化合物單獨存在時產生的效應可能不顯著，但每個化合物根據其作用大小都會對總效應產生貢獻，甚至在低于有效作用濃度下產生顯著的混合物效應。

3 討論(Discussion)

本研究采用體外人乳腺癌MCF-7細胞增殖實驗(E-screen assay)，檢測環境化合物的雌激素活性。實驗結果表明，E2單獨作用對MCF-7細胞增殖影響具有濃度-反應關系，E2在1 nmol·L-1時，細胞增殖效應最大，但是隨著濃度的增大，在高濃度時，E2抑制細胞增殖；外源性化合物DEHP和DBP的增殖效應與內源性雌激素E2的相似，在設定濃度范圍內其濃度-反應曲線均呈“S”型，但是產生的雌激素活性相對較弱，DEHP和DBP的半效應濃度EC50分別為1.186 μmol·L-1、5.138 μmol·L-1。至今為止大部分的體內實驗結果認為DBP無雌激素活性，DEHP可以改變子宮濕重，但是結果不穩定，可重復性差，猜測體內體外實驗的不一致性的原因可能是DBP和DEHP在體內被代謝分解，體內實驗表現的是代謝產物的雌激素活性[16-17]；體外實驗表現的是DBP和DEHP原型的活性。雖然在本研究中DBP和DEHP對MCF-7細胞增殖的影響均表現出較弱的雌激素活性，但是鄰苯二甲酸酯類化合物對生物有機體的生殖內分泌毒性和胚胎發育毒性是不容忽視的[1-3,18]。

環境雌激素多以混合狀態存在，且無論在環境中還是在生物體內均是與天然雌激素共同發揮作用，并且內源性雌激素和外源性環境雌激素污染物聯合作用，產生的混合效應大于單獨作用的結果[19]。因此，對E2與其他化合物共存時的雌激素活性進行研究，符合機體受環境雌激素干擾的實際情況[20]。多種化合物混合效應相較于單獨作用產生的效應更復雜，這也正是研究環境雌激素混合物效應的意義所在。

圖4 3種化合物低劑量(1/20 EC50)的混合物效應Fig. 4 Mixture effects at low-effect concentrations (one-twentieth of EC50) of three chemicals

本文在化合物單獨作用的實驗基礎上，探討雌二醇和鄰苯二甲酸酯化合物的聯合雌激素活性，主要結論如下：E2、DEHP和DBP濃度-反應關系曲線非線性，均為Weibull模型擬合度最優；內源性雌激素E2對MCF-7細胞的促增殖能力最強，外源性化合物的雌激素活性相對較弱；化合物在較低濃度下可能產生顯著的混合物效應，外源性環境雌激素與內源性雌激素聯合作用產生的混合效應顯著；3種化合物表現非相似聯合作用，混合物效應利用獨立作用(IA)模型預測較為可靠。

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◆

ModelAssessingfortheCombinationEffectsofEstrogenicActivityofPhthalates

He Ying1, Zhang Hui1,*, Zhen Shiqi2, Zhang Lijuan1, Cao Chicheng1, Zhang Qi1

1. Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China2. Institute of Food Safety and Evaluation, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Nanjing 210009, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170422001

2017-04-22錄用日期2017-05-31

1673-5897(2017)3-739-08

X171.5

A

張暉(1968-)，女，副教授,碩士生導師，研究方向為環境醫學，發表學術論文20余篇。

中央高校基本科研業務費(2242017K40041)；東南大學研討通選課程項目(1125000131；1125001508)

何穎(1993-)，女，碩士,研究方向為環境衛生學，E-mail: molahe@163.com;

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: 13851553232@163.com

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