應用微衛星標記對兩個SD大鼠封閉群的遺傳學研究

侯開領+張磊+周靜+夏介英

摘要：利用7個微衛星標記結合高分辨率全自動核酸分析系統，對四川和上海兩個不同地區生產的SD大鼠封閉群進行遺傳檢測，計算并分析其群體遺傳學參數。結果在兩個SD大鼠群體中共發現等位基因40個，每位點等位基因數4～8個，平均5.714 3個；平均期望雜合度為0.706 8；平均多態信息含量為0.663 4。兩個群體分別檢測到38和36個等位基因；平均期望雜合度分別為0.706 9和0.697 9；平均多態信息含量分別為0.655 1和0.646 1；兩個群體分別有4個位點和5個位點符合Hardy-Weinberg平衡。兩群體間Nei（1972）遺傳同一性和遺傳距離分別為0.268 2和0.764 8，Nei（1978）無偏遺傳同一性和遺傳距離分別為0.238 1和0.788 2，不同微衛星位點的平均Fst值為0.090 5，表明兩個種群的遺傳分化程度為中等分化。試驗結果表明，兩個種群都符合封閉群動物的群體遺傳特征，是比較理想的封閉群。

關鍵詞：SD大鼠；封閉群；微衛星；遺傳多樣性

中圖分類號：Q75 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3308-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.030

Genetic Analysis on Two Populations of Closed Colony Sprague-Dawley Rats Using Microsatellite DNA Markers

HOU Kai-ling， ZHANG Lei， ZHOU Jing， XIA Jie-ying

（Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu 610041， Sichuan， China）

Abstract： 7 microsatellite markers were screened by a full-automated high-resolution nucleic acid analysis system for the genetic analysis on two closed populations of Sprague-Dawley rats from two districts of Sichuan and Chengdu， and the population genetic parameters were calculated. The results showed that a total of 40 alleles were detected in two populations， with 4-8 alleles and a mean 5.714 3 alleles at each locus. The mean expected heterozygosity was 0.706 8，and the mean polymorphism information content was 0.663 4. In the two populations，38 and 36 alleles were detected，the mean expected heterozygosity was 0.706 9 and 0.697 9，and mean polymorphism information content was 0.655 1 and 0.646 1，respectively. Four loci and five loci， respectively，were in accord with Hardy-Weinberg equilibrium in the two populations. The Nei（1972） genetic identity and genetic distance between the two populations were 0.268 2 and 0.764 8，respectively. The Nei（1978） unbiased genetic identity and genetic distance between the two populations were 0.238 1 and 0.788 2，respectively. The average Fst of all loci was 0.090 5，which implied a moderate genetic differentiation between two populations. It indicated that both the two populations are consistent with a closed group of animal population genetic characteristics.

Key words： Sprague-Dawley rats； closed colony； microsatellite； genetic diversity

封閉群實驗動物具有遺傳多樣性和差異性，與人類群體遺傳類似，在人類遺傳研究、藥理毒理學研究、生物制品和化學制品的鑒定等方面起著不可替代的作用[1]。

封閉群實驗動物的遺傳質量對實驗結果的影響不容忽視，如常用于藥理及毒理學研究的封閉群大鼠，由于遺傳不穩定及不同實驗群體遺傳差異造成的藥物反應性的不一致對試驗結果造成了嚴重影響[2]。目前國際和國內對封閉群動物均缺乏統一的遺傳監測標準，其原因是由于封閉群動物的遺傳機制具有復雜性，其遺傳檢測和遺傳質量控制相對困難。因此開展封閉群大鼠的遺傳檢測研究對于其遺傳質量控制和標準化應用具有迫切性和重要意義。endprint

微衛星DNA是一類以1～6 bp核苷酸為基本序列的多次串聯重復序列，由于重復序列的數目不同，產生了DNA的多態性，又稱簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR）或短串聯重復（Short tandem tepeats）[3，4]。微衛星DNA在基因組中普遍分布、數量豐富且多態性好，能滿足對封閉群動物遺傳檢測時需要大量樣本和大量檢測位點的要求。微衛星標記應用于封閉群實驗動物的遺傳檢測具有獨特優勢和良好前景[5-7]。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

兩批封閉群SD大鼠分別購于四川和上海，生產許可證號分別為SCXK（川）2013-19和SCXK（滬）2012-0002，各30只。兩批SD大鼠均從生產群中隨機抽取，均為SPF級。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：Prime STAR HS（Premix），購自TaKaRa；DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司產品； Separation Buffer，Size Marker，Alignment Marker均由Bioptic公司提供。

儀器：PCR儀（ABI），Qsep 100全自動核酸分析系統（Bioptic），NanoDrop 2000超微量分光光度計（Thermo），Precellys 24組織勻漿機（Bertin），離心機（Thermo）等。

1.3 引物的選擇

根據文獻[8]，選擇多態性好的7個微衛星位點（R43、R63、R88、R103、R132、R142、R159）進行試驗。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 基因組的提取 取大鼠新鮮肝臟組織50 mg，利用組織勻漿機進行勻漿，之后使用DNA提取試劑盒進行基因組的提取，提取完畢后利用超微量分光光度計檢測濃度，將符合PCR模板質量要求的基因組置于-80 ℃保存。

1.4.2 PCR擴增 反應體系：2×Prime STAR HS（Premix）12.5 μL；上游引物（1 μmol/L）2.5 μL；下游引物（1 μmol/L）2.5 μL；模板（500 ng/μL）1.0 μL；ddH2O 6.5 μL。擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸3 min。利用Qsep100全自動核酸分析系統對PCR產物進行分析。

1.4.3 數據統計分析 利用Q-Analyzer軟件讀取等位基因片段大小，通過PopGene1.32[9]軟件計算觀察等位基因數、有效等位基因數[10]、觀察雜合度、期望雜合度[11]、F-統計量、Shannon信息指數、Nei遺傳相似度及遺傳距離、Hardy-Weinberg平衡等指標[12]。利用PIC_CALC軟件對每個位點進行多態信息含量（PIC）分析。

2 結果與分析

2.1 各微衛星位點在總群體上的遺傳分布

統計7個微衛星位點在兩個SD大鼠群體各個體的基因型，計算每個位點各等位基因在各群體中的基因頻率分布，結果見表1。參考引物篩選文獻[8]，等位基因大小可能有1～3個堿基的誤差。

以兩個大鼠種群為整體計算各位點的觀察等位基因數、有效等位基因數、觀察雜合度、期望雜合度、Shannon信息指數、多態信息含量、F-統計量，結果見表2。由表2可見，7個微衛星位點在兩個群體中共發現40個等位基因，每個位點4～8個，平均5.714 3個。有效等位基因數在1.779 1～5.413 5之間，平均為3.790 6；觀察雜合度在0.216 7～0.850 0之間，平均為0.614 3；期望雜合度在0.441 6～0.822 1之間，平均為0.706 8；Shannon信息指數在0.869 6～1.813 9之間，平均為1.427 8；多態信息含量（PIC）在0.411 4～0.790 0之間，平均為0.663 4。

2.2 兩個SD大鼠種群遺傳多樣性比較

由表3可見，四川種群和上海種群分別檢測到38個和36個等位基因；平均觀察雜合度分別為0.619 1和0.609 5；平均期望雜合度分別為0.706 9和0.697 9；平均多態信息含量分別為0.655 1和0.646 1；平均Shannon信息指數分別為1.394 5和1.377 0。從數值上看，兩個種群在不同遺傳多樣性參數上存在微小差異，但方差分析表明兩群體各組指數的差異均未達到顯著水平。可以看出兩個SD大鼠種群的群體多樣性相當。

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

由表4可見，四川種群有4個位點處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態，3個位點極顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡（P<0.01）；上海種群有5個位點處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態，2個位點極顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡（P<0.01）。

2.4 兩大鼠群體間的遺傳關系

遺傳分化系數（Fst）和遺傳距離結果分別見表2和表5。兩個群體7個位點的Fst范圍為0.018 4～0.204 7，平均為0.090 5，表明其群體間的遺傳變異占總遺傳變異的9.05%。兩群體的Nei（1972）遺傳同一性和遺傳距離分別為0.268 2和0.764 8，Nei（1978）無偏遺傳同一性和遺傳距離分別為0.238 1和0.788 2。

3 討論

3.1 兩個SD大鼠種群的遺傳多樣性

雜合度或群體平衡狀態是群體遺傳結構分析最直接和最有效的方法，雜合度值越高所在群體的遺傳多樣性就越豐富，較理想的封閉群體的雜合度應介于0.5～0.7。本研究中，兩群體的觀察雜合度平均值分別為0.619 1和0.609 5，推測以選定的7個微衛星位點為前提，兩個種群均屬于較為理想的封閉群種群。endprint

Hardy-Winberg遺傳平衡檢測結果顯示，四川SD大鼠種群有4個位點處于平衡狀態，上海SD大鼠種群有5個位點處于平衡狀態。可以看出以選定的7個微衛星位點為前提，兩種群中大多數位點處于Hardy-Winberg遺傳平衡狀態，推測兩個種群是比較理想的封閉群群體。少數出現偏離的原因除了無效等位基因外，還有可能是檢測的樣本數量不是無窮大，不能完全反映完整群體的遺傳狀態；另有可能是因為在SD大鼠種群的日常飼養繁殖工作中，雖嚴格進行隨機交配，但也不可避免地會出現極少量的近交現象。

3.2 兩個SD大鼠種群的遺傳關系

Fst值反應的是兩個種群間的遺傳差異。本研究中，兩個種群在7個微衛星位點的平均Fst值為0.090 5，即群體間的遺傳變異占總遺傳變異的9.05%，90.95%的遺傳變異來自群體內部的遺傳多樣性。當00.25時，表明分化極大[13]。此外，兩個群體的Nei（1972）遺傳同一性和遺傳距離分別為0.268 2和0.764 8，Nei（1978）無偏遺傳同一性和遺傳距離分別為0.238 1和0.788 2。表明群體間的遺傳分化已達中等水平。

3.3 微衛星標記在SD大鼠封閉群遺傳檢測中的適用性

封閉群動物種群具有基因多樣性，對其進行遺傳檢測，需要更多的檢測位點、更豐富的位點多態性。而目前中國國標的生化標記檢測法主要分別針對的是近交系小鼠和大鼠的13個和9個生化位點，且每個位點只有2～3個等位基因，存在檢測位點少、多態性差的問題，無法全面地反映封閉群豐富的基因多樣性和遺傳概貌。而微衛星標記具有高度多態性和在哺乳動物基因組中分布廣泛的特點，尤其適合于封閉群動物的遺傳檢測。本研究選取的7個微衛星標記，所有位點的等位基因數均在3個以上，平均為5.714 3個。

多態信息含量（PIC）是表示微衛星多態性高低的一個指標，能反映某一個遺傳標記所包含的或所能提供的遺傳信息的含量。當PIC>0.50時，表明該遺傳標記具有高度的可提供遺傳信息性，為高度多態性座位；當PIC<0.25時，表明該遺傳標記可提供的遺傳信息較差，為低度多態性座位；當0.25

另外，目前關于四川地區SD大鼠封閉群的遺傳質量相關報道較少，不清楚其遺傳質量如何。本研究針對四川地區的SD大鼠封閉群進行遺傳多樣性分析，并同上海地區做比較分析，顯示四川地區SD大鼠封閉群是比較理想的封閉群實驗動物，為豐富四川地區SD大鼠封閉群的遺傳質量信息提供了基礎資料。

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