白粉病對小麥品種西農979 籽粒淀粉合成關鍵酶基因表達的影響

李 杰，楊習文，王晨陽,3，喬芳芳，徐鳳丹，梅晶晶，賀德先

(1.河南農業大學農學院/河南糧食作物協同創新中心，河南鄭州 450002； 2.信陽農林學院農學院，河南信陽 464006；3.河南農業大學農學院/國家小麥工程技術研究中心，河南鄭州 450002)

白粉病對小麥品種西農979 籽粒淀粉合成關鍵酶基因表達的影響

李 杰1,2，楊習文1，王晨陽1,3，喬芳芳1，徐鳳丹1，梅晶晶1，賀德先1

(1.河南農業大學農學院/河南糧食作物協同創新中心，河南鄭州 450002； 2.信陽農林學院農學院，河南信陽 464006；3.河南農業大學農學院/國家小麥工程技術研究中心，河南鄭州 450002)

為了揭示白粉病對花后小麥籽粒淀粉合成的影響機制，以小麥品種西農979為材料，利用實時熒光定量PCR技術研究白粉病不同發病程度對小麥籽粒淀粉合成相關酶基因表達的影響。結果表明，隨著感病程度的增加，小麥籽粒的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因AGPase、淀粉分支酶基因SBE和可溶性淀粉合成酶基因SSS的表達均被抑制，其酶活性下降；束縛態淀粉合成酶I基因 GBSSⅠ的表達量和酶活性均高于對照；去分支酶基因DBE的表達量與對照相比沒有明顯變化，但其酶活性在病害高峰期高于對照；支鏈淀粉含量和總淀粉含量顯著降低，而直鏈淀粉含量增加。由此可知，白粉病通過改變籽粒淀粉合成相關酶基因的表達及活性而影響淀粉的積累。

小麥；白粉病；淀粉合成酶；基因表達

Abstract: To determine the impact of powdery mildew on gene expression related to starch synthesis of wheat grain,the susceptible wheat variety Xinong 979 was used as experiment material. The expression levels of five starch synthase genes were investigated by quantitative real-time PCR,including ADP-glucose pyrophosphorylase gene(AGPase),granule bound starch synthase Ⅰ gene( GBSSⅠ),soluble starch synthase gene(SSS),starch branching enzyme gene (SBE) and starch debranching enzyme gene(DBE). The change of starch synthase(AGPase,GBSSⅠ,SSS,SBE and DBE) activity was measured during grain development stages as well. The results indicated that,compared with control,the expression ofAGPase,SBEandSSSwas depressed in infected wheat during grain development. However,the gene expression level and enzyme activity of GBSSⅠ were higher in infected grains than in control. The expression ofDBEhad no significant difference in infected grains and control grains,but enzyme activity ofDBEwas higher in infected grains than in control. In addition,amylopectin content and total starch content were significant reduced in infected grains compared with control with the development of infection,but the content of amylose was increased in infected grains. These results suggested that powdery mildew could inhibit the accumulation of starch by impacting the expression levels and enzyme activities of starch synthases during grain filling stage.

Keywords: Wheat; Powdery mildew; Starch synthases; Gene expression

近幾十年來，由于灌溉條件改善、種植密度加大、氮肥施用量增加，小麥白粉病的危害日趨嚴重，其發生范圍從東南、西南沿海迅速擴展到幾乎所有的小麥種植區域，受害面積從1980年的100萬hm2發展到2010年的6.5億hm2[1]，造成小麥10%～15%的產量損失[2]，嚴重時達到20%以上[3]。在黃淮麥區，白粉病一般從小麥拔節期開始發病，抽穗期蔓延，灌漿期達到高峰，對小麥的產量和品質產生極大的影響。研究表明，白粉病發病程度與小麥收獲指數和品質呈顯著的負相關[4]。Everts等[5]發現，感白粉病的小麥出粉率較低。Gooding等[6]認為，白粉病提高了籽粒蛋白的含量，但降低了烘焙品質。馮 偉等[7]發現，隨著白粉病病情的加重，小麥籽粒醇溶蛋白和球蛋白含量增加，而清蛋白和麥谷蛋白含量降低。淀粉作為小麥主要的貯藏物質，占籽粒重量的65%～80%[8]，是小麥產量和品質性狀的主要決定因素，而有關白粉病對其合成及組分的影響卻鮮有報道。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase) 是催化淀粉合成的第一個關鍵酶，在小麥胚乳發育過程中與淀粉積累顯著正相關；束縛態淀粉合成酶Ⅰ(GBSSⅠ)催化直鏈淀粉的合成，是直鏈淀粉含量的決定因素；可溶性淀粉合成酶(SSS)和淀粉分支酶(SBE)是關鍵的支鏈淀粉合成酶[9-10]；淀粉去分支酶(DBE) 能剪切各分支鏈到適宜長度，具有整理支鏈淀粉形成的作用。本研究以西農979為材料，利用實時熒光定量PCR技術，分析白粉病對小麥籽粒淀粉合成關鍵酶基因AGPase、 GBSSⅠ、SSS、SBE和DBE的表達及酶活性的影響，探討灌漿時期葉部病害對籽粒淀粉形成和積累的影響機理，以期為該病害的有效防治及產量損失評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

供試材料為本實驗室前期鑒定的高感白粉病小麥品種西農 979，于 2015-2016 年種植于河南農業大學科教園區。田間管理同一般高產麥田。以人工接種病菌為主，接菌方法及病害處理參照馮 偉等[7]。設置 3 個白粉菌接種量處理：對照(CK，不接菌)、中量(T1，2 d 接種一次)和重量(T2，2 d 接種二次)。小區面積 12 m2(3 m×4 m)，3次重復。小區四周設置 2 m 寬隔離帶，隔離帶上播種國麥 301(高抗白粉病)。

1.2 小麥白粉病病情的調查

于花后10、15、20、25和30 d 調查小麥白粉病病情。每個時期每個小區選5點，每點調查20株，并記載各株的發病嚴重度。嚴重度記載采用改進的 0～9 級法。病情指數=[∑(各級病葉數×發病級別)/(調查總葉數×9)]×100。

1.3 淀粉合成相關酶基因表達量的測定

花后10、15、20、25和30 d分別取病級一致、長勢一致且同一天開花的麥穗，剝取穗中部籽粒30粒，迅速用液氮冷凍后，-80 ℃保存備用。

采用 Trizol 法提取小麥籽粒總 RNA，操作步驟參照李 浩等[11]。以總 RNA 為模板，按照寶生物工程(大連) 有限公司(TaKaRa) 的反轉錄試劑盒進行 cDNA 第一條鏈的合成。利用Premier 5. 0軟件，根據NCBI 公布的AGPase、 GBSSⅠ、SSS、SBE和DBE基因的mRNA 序列設計引物(表1)。以 18S為內參基因，分別對各cDNA樣品的引物特異性進行評價。引物由上海生物工程有限公司合成。熒光定量PCR 反應在美國伯樂iQ5實時熒光定量PCR儀上進行。3 次生物學重復。qRT-PCR 反應體系為20 μL：cDNA 2 μL、上下游引物各0.4 μL、SYBR Premix ExTaqTM(2×)10 μL、ddH2O 7.2 μL。反應程序：95 ℃預變性 3 min；95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸20 s，45 個循環。按照 2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.4 淀粉合成相關酶活性的測定

參照 Cheng 等[12]的方法測定AGPase、GBSSⅠ、SSS和SBE酶活性。

1.5 淀粉含量的測定

參照楊 毅等[13]的方法，利用雙波長比色法分別測定樣品在波長為 530、495、654和 565 nm的吸光值，△A(直)= A495-A530，△A(支)= A565-A654。根據兩類淀粉的雙波長標準曲線，計算出樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。二者相加即為總淀粉含量。

表1 用于分析目標基因表達的引物序列Table 1 Primer sequences used for analyzing the expression of target genes

2 結果與分析

2.1 西農979的白粉病病情調查結果

西農979的對照組在整個籽粒發育過程中并沒有出現白粉病，而2個處理組的白粉病病情指數從花后 10 d 開始迅速增加，持續到花后 20 d；隨著氣溫的不斷升高，病情指數增速變慢，兩個處理均在花后25 d達到最大值，中度(T1)和重度(T2)的病情指數分別為 44.5 和 65.2；花后 30 d 時，大氣溫度過高抑制了白粉菌的生長、發育，病情指數呈現出略微的下降趨勢(圖1)。

圖1 白粉菌侵染后西農979籽粒不同發育時期的病情指數

2.2 白粉病對西農979籽粒淀粉合成關鍵酶基因表達的影響

白粉病對西農979籽粒淀粉合成關鍵酶基因的表達產生了顯著的影響。由圖2可知，4種淀粉合成酶基因(AGPase、 GBSSⅠ、SSS和SBE)于花后10 d時相對表達量迅速增加，在15 d時達到最大，然后急劇下降，30 d時降至最低；而DBE基因則在花后10 d的相對表達量最大，隨著籽粒的發育，其表達量迅速下降。隨著白粉病病情的加重，AGPase基因的相對表達量顯著降低，尤其是花后15和20 d，在T1處理下，該基因的相對表達量分別為對照的80.4%和75.6%，T2處理下，該基因的相對表達量分別僅為對照的52.2%和35.6%；SSS和SBE基因的相對表達量也明顯低于對照，特別是在白粉病高發期(花后25 d)，在T1處理下，兩種基因的相對表達量分別比對照低11.4%和14.6%，在T2處理下，兩種基因的相對表達量分別比對照低28.6%和31.7%；與對照相比， GBSSⅠ基因相對表達量卻呈增加趨勢，在白粉病病情指數最大時期比對照增高最多，達16.7%，而在T1處理下，該基因的相對表達量與對照差異不大；白粉病病害程度對DBE基因相對表達量的影響不明顯，即使在白粉病的高發期(花后 20～25 d)，在T1與T2處理下，該基因的相對表達量與對照相比沒有明顯變化。

2.3 白粉病對西農979籽粒淀粉合成關鍵酶活性的影響

由圖3可知，白粉病對西農979籽粒淀粉合成關鍵酶活性產生了顯著影響。隨著病情指數的增加，除花后10 d外，AGPase、SSS和SBE的酶活性比對照顯著降低。病害越重，3種酶活性降低越多。在籽粒灌漿期，在對照條件下，AGPase、SSS和SBE的酶活性呈現出先升高后降低的趨勢，并在花后25 d達到最大值；在T1處理下，3種酶活變化趨勢與對照類似；在T2處理下，AGPase和SSS酶活性峰值出現在花后20 d，且變化幅度小于對照和T1處理。GBSSⅠ酶活性隨著籽粒的發育逐漸增加，并在花后25 d 酶活性達到峰值，隨后略微下降，在T2處理下，該酶活性在花后10 d 比對照略低，在花后20～30 d 比對照高，而T1處理下沒有明顯變化。DBE酶活性隨著籽粒灌漿的進行呈降-升-降的變化趨勢，花后 10 d時，該酶活性最大，其后顯著下降，在花后15～25 d時略微升高，花后 30 d又急速降低；在T1、T2處理下，該酶活性在籽粒發育過程中與對照相比差異不大，但在花后 25 d，T1處理該酶活性比對照增高7.0%，T2處理的比對照增高12.3%。

*和**分別表示與對照差異在0.05和0.01水平上顯著。

* and ** indicate the difference between the treatment and the control was significant at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

圖2白粉病對西農979花后不同時期籽粒中AGPase、GBSSⅠ、SBE、SSS和DBE基因表達量的影響

Fig.2ImpactofpowderymildewontheexpressionlevelofAGPase、GBSSⅠ、SBE、SSSandDBEgenesinwheatgrainsduringdifferentperiodspostanthesis

圖3 白粉病對西農979花后不同時期籽粒中AGPase、GBSSⅠ、SBE、SSS和DBE酶活性的影響

2.4 淀粉合成酶基因表達與淀粉合成酶活性的相關性

由于AGPase、 GBSSⅠ、SSS和SBE淀粉合成酶基因表達高峰期都在花后15 d，因此，本研究僅分析花后15 d時 5 種籽粒淀粉合成關鍵酶基因相對表達量與對應酶活性的相關性。結果(表2)表明，在對照條件下，AGPase、SSS和SBE基因的相對表達量與相應的酶活性呈顯著正相關，而 GBSSⅠ和DBE基因相對表達量與其酶活性相關不顯著；在T1處理下，AGPase基因的相對表達量與相應酶活性呈極顯著正相關，而其他基因的相對表達量與對應酶活性相關不顯著；在 T2 處理下，AGPase、 GBSSⅠ和SBE基因相對表達量與相應酶活性呈顯著正相關，SSS和DBE基因的相對表達量與酶活性相關不顯著。由此可見，不同的白粉病發病程度對不同淀粉合成酶基因的表達量與其相應的酶活性的相關性產生不同的影響。

表2 AGPase、 GBSSⅠ、SBE、SSS和DBE基因表達量與相應酶活性的相關系數Table 2 Correlation coefficients between gene expression and activities of starch synthases in wheat grains

*表示顯著相關(P<0.05) ；**表示極顯著相關(P<0.01) 。

* and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.5 白粉病對西農979籽粒淀粉含量的影響

與對照相比，隨著病害程度的增加，西農979籽粒中直鏈淀粉含量和淀粉直/支比逐漸增高，而支鏈淀粉含量和總淀粉含量逐漸降低(圖4)。在花后 10 d時，病害對直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量和總淀粉含量影響不大；隨著白粉病的迅速發展，在花后 25 d時，病情指數達到最大值，此時 T1 處理的支鏈淀粉含量和總淀粉含量分別比對照降低 11.5% 和 7.3%，T2 處理的支鏈淀粉含量和總淀粉含量分別比對照降低19.3%和13.0%；T1、T2 處理的直鏈淀粉含量分別比對照增高18.1%和25.3%。由此可見，白粉病危害下小麥籽粒總淀粉含量的降低主要是因為支鏈淀粉合成的減少。

圖4 白粉病對西農979籽粒淀粉積累的影響

3 討 論

淀粉作為小麥籽粒重要的組成部分，其含量對產量和品質有很大的影響。籽粒胚乳中淀粉合成的碳源主要來源于兩個方面，一是花后葉片和穗器官中的光合產物，二是營養器官中的非結構碳水化合物的再動員[14]。在籽粒發育過程中，病害脅迫如葉部和穗部病害會影響籽粒的直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量和總淀粉含量，并最終決定了淀粉性狀的優劣；如已有研究發現葉枯病和黑胚病導致小麥籽粒容重下降，出粉率降低[15-16]。本試驗中，白粉病顯著降低籽粒的總淀粉含量和支鏈淀粉含量，損失率分別高達13.0%和19.3%，而直鏈淀粉含量卻比對照增高25.3%。淀粉組分的變化會對面條品質，特別是面條質地，產生很大的影響[17]。直鏈淀粉含量增加時，面條硬度增加，持水力和彈性降低，而直鏈淀粉含量較低時，面條的韌性和食用品質較高[18-19]。已證明白粉病導致面粉的淀粉峰值黏度、最終黏度、低谷黏度和反彈值降低，最終造成面條外觀和質地變差[7]。因此，白粉病通過改變淀粉組分的含量影響面條品質。

小麥籽粒中參與淀粉合成的酶有很多，關鍵的淀粉合成酶主要包括 AGPase、GBSSⅠ、SSS、SBE和DBE。花后11～15 d 是小麥籽粒淀粉合成和貯藏的關鍵時期，4 種淀粉合成關鍵酶基因(AGPase、 GBSSⅠ、SSS和SBE)在花后12～15 d 表達量達到最大值，相應的酶活性在花后25 d左右達到最大，此時籽粒灌漿速率最高[13,20-21]。然而由于氣候原因，在有“中原糧倉”之譽的黃淮平原，白粉病的高發期常常出現在籽粒灌漿的中后期(花后20～25 d)，造成同化產物含量降低、運輸受阻，嚴重影響了籽粒的灌漿速率，造成極大的經濟損失。本研究結果顯示，感病處理的AGPase、SSS和SBE基因的相對表達量比對照顯著降低，尤其是AGPase，其基因相對表達量在花后20 d 僅為對照的35.6%。AGPase是淀粉合成的限速酶，感病小麥籽粒中該酶基因的相對表達量及酶活性的顯著下降可能是造成籽粒總淀粉含量下降的主要原因。SSS和SBE基因主要影響支鏈淀粉的合成。在白粉病高發期，小麥籽粒中這兩種酶基因的表達量僅為對照的28.6%和31.7%，且這兩種酶的活性在感病處理的小麥籽粒中也顯著下降。這些結果說明白粉病抑制了小麥籽粒支鏈淀粉的合成，導致籽粒中支鏈淀粉含量降低。 GBSSⅠ與直鏈淀粉合成相關，該基因的相對表達量在病害最嚴重時(花后 25 d)比對照增高達16.7%，這可能是造成感病處理籽粒中直鏈淀粉含量升高的一個原因。此外，在本試驗中還發現，與對照相比，與支鏈淀粉分解相關的DBE基因的相對表達量在感病處理中沒有明顯變化，但其酶活性在T1和T2處理中分別比對照增高7.0%和12.3%。感病處理籽粒中DBE基因的相對表達量和酶活性的不一致性可能是由于其基因表達受到了轉錄或翻譯水平上的修飾作用，造成相應酶活性發生變化。從以上結果可以看出，白粉病通過調節籽粒中淀粉合成關鍵酶的表達和相應的酶活性來影響籽粒淀粉的含量，從而造成小麥產量和品質的改變。

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ImpactofPowderyMildewonGeneExpressionRelatedtoStarchSynthesisofWheatCultivarXinong979

LIJie1,2,YANGXiwen1,WANGChenyang1,3,QIAOFangfang1,XUFengdan1,MEIJingjing1,HEDexian1
(1.College of Agronomy,Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops,Zhengzhou,Henan 450002,China; 2.College of Agronomy,Xinyang Agriculture and Forestry University; 3.College of Agronomy,Henan Agricultural University/National Engineering Research Center for Wheat,Zhengzhou,Henan 450002,China)

時間：2017-09-13

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170913.1138.004.html

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)09-1148-07

2017-03-02

2017-07-22

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAD07B07)；河南省重點實驗室項目(132300413207)

E-mail：ljljlxh123@126.com

賀德先(E-mail：hedexian@126.com)